检索历史 清除

摘要近年来，质粒介导黏菌素耐药基因mcr-1的出现和快速传播，给临床治疗带来了挑战。本文旨在研究mcr-1基因对多种革兰阴性杆菌介导的黏菌素耐药水平及其作用机制，同时研究mcr-1基因不同表达水平对大肠杆菌产生的适应性代价及其可能存在的适应性机制，为防止黏菌素高耐药菌的出现提供科学依据，为新药研发和耐药性控制提供理论依据。<br>　　本研究将携带mcr-1基因的克隆重组质粒分别电转化入不同革兰阴性杆菌，获得重组菌分别用于最小抑菌浓度（MIC）值的测定和脂质A结构鉴定。结果显示，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的重组菌对黏菌素的MIC提高了16～＞128倍（2～＞128mg/L），铜绿假单胞菌的重组菌MIC值只提高了2～4倍（1～8mg/L）。脂质A的质谱检测结果证实了MCR-1功能，即通过转运磷酸乙醇胺对细菌细胞膜上的脂质A进行修饰，导致革兰阴性杆菌对黏菌素耐药。<br>　　构建mcr-1基因及其突变基因mcr-1(E246A)的pBAD表达重组质粒，将空载体质粒和重组质粒分别转入E.coliTOP10，获得遗传背景一致的三株重组菌。检测重组菌在不同浓度的阿拉伯糖（0.02%～2%，w/v）诱导下黏菌素的MIC值和体外生长活性的变化，并采用RT-PCR方法检测mcr-1的表达水平。结果显示，E.coliTOP10[pBAD和pBAD-mcr-1(E246A)]对黏菌素的MIC值都保持不变（0.5mg/L），E.coliTOP10+pBAD-mcr-1在0.2%阿拉伯糖诱导条件其MIC值最高（2mg/L）。生长曲线结果显示，在8h时，与对照组相比，在0.02%～2%阿拉伯糖的诱导条件下，E.coliTOP10[pBAD-mcr-1和pBAD-mcr-1(E246A)]的生长活性明显发生下降（降低2log10～3log10CFU/mL），在24h所有细菌的菌落数都恢复到与对照组相同。RT-PCR结果显示，在8h时，随着诱导浓度的提高，mcr-1基因的表达水平先升高后下降；在24h时，mcr-1基因的表达水平都显著性下降。结果表明mcr-1基因的表达水平受到细菌严格控制，mcr-1基因的过表达降低宿主菌的生长活性，细菌表现出严重的适应性代价。<br>　　利用流式细胞仪和透射电子显微镜，评估过表达mcr-1及其突变基因mcr-1(E246A)对宿主菌膜电位和细胞形态学的影响。结果显示，在8h，过表达的mcr-1及其突变基因mcr-1(E246A)均破坏细胞膜的膜电位，破坏细胞膜渗透性和细胞膜结构的完整性；在24h时，细菌的细胞膜电位和形态结构恢复正常。<br>　　采用高转录组学测序技术，从转录水平研究mcr-1基因对宿主菌造成适应性代价的可能机制。结果显示，相比于对照组，mcr-1基因的过表达对宿主菌造成829个差异表达基因，其中参与跨膜结构的磷酸转运系统（PTS）的基因（gatA、gatB、gatC、ptsH和ptsO等）变化最为显著，其表达水平显著性下降，可能破坏了细菌对外源性糖类的摄取。通过亚细胞分离技术提取细胞膜，结合细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳分析，发现过表达mcr-1基因可能干扰了细胞膜蛋白的表达。在能量代谢通路中，参与半乳糖代谢的大部分基因（glf、ilacZ和galT等）表达水平下降，而参与丁酸乙酯代谢的部分基因（gabD、yihU和frdD等）表达水平上升，说明细菌能量代谢平衡失调。另外，编码脂多糖核心多糖的基因（waaU、waaR、wcaO和waaB等）表达水平发生显著性下降，可能导致细胞膜核心多糖结构残缺。<br>　　采用非靶向代谢组学技术，从代谢水平研究mcr-1及其突变基因mcr-1(E246A)对宿主菌造成适应性代价的可能机制。结果显示，差异代谢物主要参与肽类代谢、脂质代谢，同时也参与细胞内多个代谢通路（包括氨基酸、碳水化合物和能量代谢等），随着mcr-1基因表达水平的下降，其对宿主代谢的影响明显减小。mcr-1突变基因(E246A)的过表达对宿主菌造成的差异代谢变化趋势与mcr-1的相似，推测跨膜蛋白MCR-1对细胞膜空间结构的损伤是其造成适应性代价的主要原因。进一步分析脂质代谢中的差异代谢物，主要表现为膜磷脂成分的合成前体物质（脂肪酸和磷脂酸）的代谢水平显著性上升，而细胞膜磷脂成分（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂）的代谢水平显著性下降，说明mcr-1基因的过表达可能破坏了细胞膜的正常结构，也解释了细胞膜渗透性受损的原因。另外，通路富集分析显示，过表达的mcr-1基因对宿主菌的辅酶A合成（乙酰乳酸、3'',5''-ADP和辅酶A等）、磷酸戊糖途径（丙酮酸，6-磷酸葡萄糖胺和磷酸烯醇丙酮酸盐PEP等）的影响最大，引起细胞碳水化合物代谢异常，同时造成能量代谢产物（ATP、ADP、NADP+）的下降。<br>　　综上所述，本研究首次验证了MCR-1能够对不同革兰阴性杆菌脂质A进行磷酸乙醇胺修饰，导致黏菌素耐药。另外，本研究明确了过表达mcr-1可降低细菌生长活性、破坏细胞膜结构和功能的完整性，推测位于细胞膜的MCR-1蛋白空间结构可能是其对宿主菌造成适应性代价的主要原因，为其他编码跨膜蛋白基因对细菌的适应性代价及其机制研究提供了科学数据。