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摘要目的：<br>　　胞外组蛋白会损伤单器官。本研究将阐述循环组蛋白是否以第二次打击的方式介导创伤、急性胰腺炎、脓毒症等原发性急重症时MODS的发生与发展，与此同时还对急重症模型小鼠的高浓度循环组蛋白的来源进行初步探讨。<br>　　方法：<br>　　总体来说，主要通过将临床研究、体外实验以及建立创伤、急性胰腺炎和脓毒症等急重症动物模型相结合的方式阐明循环组蛋白在临床常见急重症时MODS发生与发展中的作用；通过体内、外实验对脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的来源进行初步探讨。<br>　　1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义<br>　　2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用<br>　　3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用<br>　　4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨<br>　　由于在脾脏切除术后继续对实验小鼠进行CLP操作会造成额外的损伤，进而可能影响脓毒症的自然发病过程；革兰氏阴性杆菌感染依然在细菌性脓毒症的病因中占有重要地位，而定量细菌腹腔注射法建立小动物脓毒症模型具有操作简便、效果明显且稳定的特点，故在此通过腹腔注射大肠杆菌K-12的方式对脾脏切除后的C57BL/6j小鼠诱发脓毒症。由于缺乏胸腺的BALB/c nude小鼠自身具有免疫缺陷性，这些小鼠的经细菌性腹膜炎（CLP术或腹腔注射大肠杆菌）导致脓毒症的病程可能不利于揭示循环组蛋白水平的变化特点，在此情况下使用造模成分明确且效果可靠、即腹腔注射LPS成为诱导BALB/c nude小鼠发生脓毒症的首选替代方法。将凋亡标记蛋白Annexin-V与荧光素m-Cherry联合形成Annexin-V/m-Cherry耦合物，因此在近红外激发光下m-Cherry的荧光强度标志着凋亡信号的强弱。<br>　　通过近红外成像技术比较脓毒症模型小鼠在静脉注射m-Cherry/Annexin-V后多脏器的荧光强度；腹腔注射大肠杆菌K-12后的C57BL/6j小鼠在不同时间点接受皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK；向健康的C57BL/6j小鼠尾静脉注射小牛胸腺组蛋白以探讨高浓度的循环组蛋白是否会引起脾细胞发生过度凋亡；经Hamp;E染色、抗激活型Caspase-3免疫组化的方法观察各种方式处理后小鼠的多脏器组织病理学特点；比较野生型BALB/c、BALB/c nude及脾脏切除后的BALB/c nude小鼠在接受腹腔注射LPS后40h左右的生存率。<br>　　目前人们普遍认为细胞坏死而并非细胞凋亡过程能够释放组蛋白到细胞外。糖皮质激素不仅是引发淋巴细胞凋亡的典型信号，也是临床通过诱发凋亡治疗骨髓瘤、白血病等恶性血液肿瘤的常用化疗药物。为明确细胞在发生凋亡过程中是否会直接释放组蛋白到细胞外，在体外实验中先采用水溶性糖皮质激素处理人B淋巴细胞系Daudi细胞、人T淋巴细胞系Jurkat细胞，然后经流式细胞术检测两种细胞的凋亡情况，通过WB法检测并比较细胞培养上清中组蛋白H3的含量变化情况。<br>　　结果：<br>　　1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义<br>　　总体看来，所有纳入ICU的急重症病人入院时循环组蛋白浓度[24.7（8.0,46.7）μg/ml]明显高于健康献血者[1.3（0,2.1）μg/ml]。按病因对纳入病人分类后可见，重度创伤、重症胰腺炎、脓毒症患者入院时循环组蛋白水平较其他病种患者的显著升高，但这三种疾病患者之间循环组蛋白浓度差异无统计学意义。Spearman秩相关性检验表明，纳入病人入院时循环组蛋白水平与肝功能[ALT（rs=0.545;P＜0.0001）]、肾功能[BUN（rs=0.496;P＜0.0001）]、呼吸功能[PaO2/FiO2（rs=-0.360;P=0.015）]损伤以及心肌损伤标志物[cTnT（rs=0.607;P＜0.01]升高之间均存在正相关性；入院伴发MODS或住院28天内死亡病人的入院时循环组蛋白浓度明显偏高{[30.1（7.3,63.2）μg/ml vs.10.8（4.3,30.1）μg/ml;P＜0.0001]、[32.7(14.4,66.9)μg/ml vs.20.1(6.7,40.5)μg/ml;P＜0.0001]}。另外，纳入病人入院时循环组蛋白浓度不仅能预测入院后48h-72h之间MODS发生情况，还有助于推断病人住院后28天病死率。<br>　　2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用<br>　　健康人血清在加入外源性组蛋白后会对人内皮细胞系EA.Hy926产生剂量依赖性的毒性作用，当用组蛋白浓度≥30ug/ml的病人血清处理EA.hy926细胞后，其存活率也显著降低；与此相反，用胞外组蛋白拮抗剂ahscFv或Heparin处理均可显著降低胞外组蛋白对EA.Hy926内皮细胞的毒性作用。用含50μg/ml小牛胸腺组蛋白的健康人血清或组蛋白含量也超过50μg/ml的急重症病人血清处理不同器官来源的细胞（小鼠心肌细胞、人肝细胞、人肾皮质上皮细胞和人支气管-肺泡上皮细胞）后，这些细胞的存活率均明显下降。<br>　　3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用<br>　　循环组蛋白的浓度—时间曲线表明，中度创伤、次重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的循环组蛋白浓度峰值时间分别为建模后8h、16h、16h；各类疾病模型小鼠在各达峰时间的循环组蛋白浓度随病情加重而升高。经相关性分析后发现，各类疾病模型小鼠的循环组蛋白浓度与受损的肝功能（ALT）、肾功能（BUN）及升高的肌钙蛋白I（cTnI）、肺组织损伤评分得分（lung injuryscore，LIS）均呈正相关；ahscFv、Heparin抗组蛋白治疗能显著改善重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的ALT、BUN、cTnI、LIS等受损脏器功能指标；其中，无论在建模前还是建模后开始抗组蛋白治疗，重度CLP模型小鼠的72h存活率均得以显著改善。多脏器组织切片抗激活型Caspase-3免疫组化检测发现，重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的胸腺与脾脏存在细胞过度凋亡现象。<br>　　4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨<br>　　经腹腔注射适量大肠杆菌K-12能成功诱导野生型C57BL/6j小鼠发生脓毒症，同时细菌注射后10h循环组蛋白浓度达到较高水平（322.8±100.6μg/ml），此后其值持续升高，峰值时间约在注射细菌后16h左右（478.2±166.4μg/ml），且在24h仍处于高水平（424.8±154.1μg/ml）。多脏器近红外成像结果表明，从腹腔注射细菌后4h开始，C57BL/6j小鼠胸腺与脾脏的凋亡信号已明显升高，其中胸腺的凋亡信号一直持续升高到注射细菌后24h，脾脏凋亡信号高峰时间是细菌注射后8h；脏器组织切片Hamp;E染色与抗激活型Caspase-3免疫组化染色结果显示，腹腔注射大肠杆菌后24h左右C57BL/6j小鼠的胸腺与脾脏淋巴细胞数大幅减少，两者均存在大面积细胞凋亡现象，而心、肝、肾等重要器官均未见明显的实质细胞凋亡；统计学分析发现，脓毒症模型小鼠的脾脏凋亡细胞数目与循环组蛋白浓度升高呈正相关（r=0.78；P＜0.001）。<br>　　将一定剂量的小牛胸腺组蛋白经尾静脉注射到C57BL/6j小鼠体内，循环组蛋白升高水平与小鼠发生严重脓毒症时相似，但免疫组化检查结果并未显示脾脏淋巴细胞凋亡增加，据此推断模型小鼠脾脏与胸腺细胞凋亡是循环组蛋白的来源，而不是循环组蛋白作用结果。皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK能阻断细胞凋亡，循环组蛋白浓度也相应降低，提示细胞凋亡促进了循环组蛋白浓度的升高。还发现，脾脏切除后的C57BL/6j小鼠再经腹腔注射大肠杆菌K-12诱发脓毒症时，其循环组蛋白水平较未切除脾脏组显著降低（137.4.57±31.2μg/ml vs.53.8±21.8μg/ml；P＜0.001）；与WTBALB/cnude小鼠比较（84.57±13.51μg/ml），胸腺缺失（BALB/c nude小鼠）（33.49±7.59μg/ml）或胸腺缺失联合脾脏切除（BALB/cnude小鼠+脾脏切除术）（13.47±3.27μg/ml）能有效降低经腹腔注射LPS诱发脓毒症时的循环组蛋白水平并显著改善建模后实验小鼠的40h存活率。体外培养的Daudi细胞（B淋巴细胞系）、Jurkat细胞（T淋巴细胞系）均随氢化可的松剂量依赖的、不同程度的细胞凋亡（AnnexinV+），蛋白质免疫印迹法也证实未经糖皮质激素处理的淋巴细胞上清未见明显的组蛋白H3条带，而糖皮质激素处理的两种淋巴细胞上清液存在氢化可的松剂量依赖的、浓度高低不等的组蛋白H3。<br>　　结论：<br>　　1.重度创伤、重症胰腺炎及脓毒症等急重症患者入院时的高水平循环组蛋白与MODS进展及不良预后密切相关。<br>　　2.添加外源性组蛋白后的健康人血清或含高水平循环组蛋白的急重症患者血清均对多器官来源的细胞产生由组蛋白介导的、非细胞特异性的毒性作用；抗组蛋白处理能有效抑制这种细胞毒性效应。<br>　　3.在实验小鼠发生重度创伤、TCL胰腺炎（重症胰腺炎）、重度CLP（重度脓毒症）等多种原发性急重症后，循环组蛋白通过直接作用、以第二次打击的方式同时损伤多个脏器从而参与介导了MODS的发生与发展；抗组蛋白治疗有效改善以上急重症模型小鼠的MODS，显著提高重度脓毒症模型小鼠的存活率。<br>　　4.胸腺与脾脏是脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的重要来源，具体机制主要涉及脓毒症时胸腺与脾脏细胞的过度凋亡。