检索历史 清除

摘要CRISPR-Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatsandCRISPR-associatedgenes)系统是存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统。本研究以冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)为研究材料，该菌株编码III型CRISPR-Cas系统。当外源遗传物质入侵时，III型CRISPR-Cas系统被激活产生免疫效应，行使靶标RNA切割活性、单链DNA切割活性及环寡聚腺苷酸(cyclicoligo-adenylate,cOA)合成活性。其中，cOA能够作为第二信使进一步激活体内非特异性RNase活性，从而抑制病毒的复制。然而由于RNase活性为非特异性，有可能引起细胞休眠甚至死亡，因此需要在免疫应答结束后及时清除。已有文献发现在Sulfolobussolfataricus菌株中编码一种含特殊CARF结构域的蛋白，ringnuclease。该蛋白具有不依赖于金属离子的cOA降解酶活性，可以特异性地结合并降解cOA。而在前期研究中，发现冰岛硫化叶菌的细胞裂解液中存在着不同于ringnuclease的、依赖于金属离子的具有cOA降解酶活性的组分。在前期研究的基础上，本研究鉴定冰岛硫化叶菌中的新型cOA降解酶，并研究其生化性质与体内功能。获得了实验结果如下：<br>　　1.将前期实验得到的具有cOA降解酶活性的组分进行逐步分离纯化并质谱鉴定，发现4个可能为cOA降解酶的备选蛋白。分别表达纯化这4种蛋白，进行活性鉴定，最终发现只有SiRe_0244具有cOA降解活性。经过进一步研究，本研究确定SiRe_0244为与细胞膜相关的、属于DHH-DHHA1家族的cOA降解酶，命名为MAD(membrane-associatedDHH-DHHA1familynuclease)。MAD有较强的cOA降解酶活性，且其活性远大于ringnuclease。并且由于MAD降解cOA，Csx1蛋白无法被激活，从而抑制cOA激活Csx1产生RNase活性。<br>　　2.已知DHH-DHHA1家族主要成员包括外切核酸酶、NanoRNase、环核苷酸磷酸二酯酶等，它们在核酸代谢、DNA复制与修复等细胞的稳态维持及应激耐受等细胞过程中发挥作用。而本研究也发现，MAD有广泛的核酸酶活性。且MAD蛋白的三个保守位点中，将D10-D12位点突变成A(M1,D10A-D12A)，蛋白D10A-D12A失去ssDNA、dsDNA降解活性，将D87-H88-H89位点突变成A(M2,D87A-H88A-H89A)，D87A-H88A-H89A蛋白失去所有核酸降解活性，将H271位点突变成A(M3,H271A)，蛋白失去ssDNA、dsDNA降解活性。<br>　　3.以ΔβE233菌株为模板构建SiRe_0244缺失株得到ΔβE233Δ0244。对ΔβE233、ΔβE233Δ0244进行转录组测序，分析测序结果并结合qPCR实验数据，发现MAD能调控鞭毛相关基因的表达。分别观察野生型菌株以及突变型菌株的表型，发现MAD的缺失能促进菌株鞭毛的形成，以及细胞膜表面其他未知物质的形成。<br>　　综上，本研究在冰岛硫化叶菌中发现鉴定出了MAD蛋白，该酶有较强的cOA降解活性，可能与ringnuclease协同参与CRISPR-Cas系统的免疫调节。并且该酶属于DHH-DHHA1家族，有较强的核酸酶活性，因此该酶除了参与降解cOA外，可能还参与其他体内功能。本研究还证明MAD参与抑制冰岛硫化叶菌鞭毛相关基因的表达调控，SiRe_0244基因的缺失促进菌株鞭毛及膜表面未知物质的形成。但其具体调控机制还不太清楚。