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摘要甘露聚糖酶是降解半纤维素的主要酶类之一，因其功能已被广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸等行业。本课题以实验室前期获得来源于嗜热好氧细菌的一种耐热甘露聚糖酶ManA（AccessionNo.KJ806637）为研究对象，将其在毕赤酵母中进行分泌表达，探究胞内共表达HAC1或毕赤酵母蛋白折叠相关分子伴侣对ManA分泌表达酶活的影响，在此基础上结合融合多聚氨基酸、增加基因剂量、共表达血红蛋白等策略提高ManA的分泌表达酶活，具体研究内容及结果如下：<br>　　（1）共表达HAC1或蛋白折叠相关分子伴侣对ManA分泌酶活的影响<br>　　在分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达毕赤酵母内质网未折叠蛋白响应（UnfoldedProteinResponse，UPR）激活调控因子HAC1或5种毕赤酵母蛋白折叠相关分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP，探究共表达上述蛋白对ManA分泌表达酶活的影响，结果发现胞内共表达HAC1、ERO1或PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别有不同程度的提升，其中共表达HAC1的重组菌GS115/ManA-HAC1发酵上清液的酶活力最高，在120h达到474U/mL，相比对照菌提高了26%。在此基础上进一步将HAC1、ERO1和PDI进行两基因或三基因组合，并分别在分泌表达ManA的重组菌中胞内共表达，但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力均没有明显的进一步的提升。<br>　　（2）ManA在毕赤酵母中高效表达重组菌的构建及酶活分析<br>　　为提高ManA在毕赤酵母中的分泌酶活，依次采用融合表达多聚精氨酸、增加基因剂量、胞内共表达HAC1、胞内共表达血红蛋白VHb四种方法，发现在ManA的C端融合多聚精氨酸后重组菌上清液的酶活力提高2%，达到365U/mL；进一步构建多拷贝重组菌，筛选获得5拷贝重组菌的酶活力进一步提高15%，达到391U/mL；在5拷贝重组菌GS115/5ManA-R6的胞内共表达HAC1，但上清酶活并没有进一步的提升；随后在5拷贝重组菌GS115/5ManA-R6的胞内共表达血红蛋白VHb，重组菌上清酶活力进一步提高6%，达到了402U/mL。但是对重组菌GS115/ManA-HAC1、GS115/5ManA-R6、GS115/5ManA-R6-HAC1和GS115/5ManA-R6-VHb的酶活进行比较后发现，GS115/ManA-HAC1的上清酶活却是最高，达474U/mL，因此在选择使用提高ManA分泌酶活的策略中，应优先考虑共表达HAC1，且在表达ManA时一种有效的策略有时可能比其它几种不同策略的组合更加有利。上述结果表明在一些提高外源蛋白表达量策略的组合使用中，多种策略的组合使用并不一定都能进一步促进外源蛋白的分泌表达。