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摘要肿瘤的生长、浸润和转移依赖于新血管的生成。人纤溶酶原Kringle5是目前发现的最具有潜力的新生血管抑制剂之一，在治疗血管性疾病和肿瘤方面具有广泛的应用前景。目前关于Kringle5的研究主要集中在其抑制新生血管机制方面，而对其在体内的结合靶点以及作用机理研究甚少。<br>　　实验室前期通过噬菌体展示7肽库已经筛选出了与Kringle5具有高亲和力的短肽（IGNSNTL）。在本工作中，结合BLAST工具搜索Kringle5的体内结合蛋白，并根据匹配氨基酸个数、E值大小以及蛋白功能对所得蛋白进行了排序，发现cochlin的vWA1结构域可能是Kringle5的体内结合靶点之一。在此基础上，通过blot overlay、磁珠法、酶联免疫吸附和前沿色谱对它们之间的相互作用进行实验验证，并借助动力学模拟分析进一步探究了Kringle5与vWA1结构域之间的结合过程，为Kringle5的作用机理研究和药物开发奠定了一定的基础。全文主要内容如下：<br>　　1.通过筛选初步确定cochlin的vWA1结构域可能是Kringle5的体内结合靶点之一，对vWA1结构域进行克隆表达，发现其以包涵体形式存在，稀释透析复性后获得了vWA1蛋白，经测定浓度为0.46mg/mL。<br>　　2.通过blot overlay和镍离子螯合磁珠实验，证明了Kringle5与vWA1之间存在相互作用；酶联免疫吸附试验联合生物素-亲和素体系进一步揭示二者作用的特异性和饱和性，二者的解离常数Kd为0.16μM，表明二者存在较强的相互作用；采用重氮盐法制备固定化Kringle5色谱柱，并通过前沿色谱实验分析得出Kringle5与vWA1之间的结合常数Ka为4.18×104L/mol，且Kringle5与vWA1之间仅存在一类结合位点。<br>　　3.通过同源建模并结合动力学优化确定了vWA1的最终三维结构。该结构由6个α-螺旋围绕中央的5个β-片层组成，符合Rossmann型折叠；将Kringle5与vWA1进行分子对接，将对接复合物进行动力学优化，并对最佳复合物构象进行分析发现，在Kringle5与vWA1作用时参与的氨基酸有Arg32、Arg69、Lys70、Leu71、Tyr72和Tyr74，推测二者可能是通过赖氨酸结合位点结合的；通过MM/GBSA法能量分解发现Kringle5中的Tyr72贡献值最大。定点突变后，由Tyr72贡献的范德华力增加了57.2%，结合自由能增大，表明Tyr72确实为关键氨基酸残基；vWA1与Kringle5作用后，位于结合面的loop1（47-50）和loop2（110-118）发生明显波动。loop3（154-165）处也有较大波动，且部分α6-螺旋（149-153）变为无规卷曲，说明二者结合存在诱导契合效应。