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摘要骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，可以分化为成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞和成肌细胞等，其中BMSCs向成骨细胞分化和脂肪细胞分化存在“此消彼长”的关系。骨质疏松症已成为危害中老年人健康的第四大慢性疾病，其特征是成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间不平衡。越来越多的临床观察发现，在由年老、绝经、药物治疗等引起的骨质疏松症中，骨量减少和骨髓腔内脂肪细胞增多相伴存在，因此，促进BMSCs向成骨细胞分化已经成为研究热点。磷脂型DHA/EPA是一种新型海洋脂质，DHA/EPA结合于磷脂的Sn-2位，拥有磷脂酰胆碱和ω-3多不饱和脂肪酸的双重生物学活性。本实验室前期研究表明，富含磷脂型DHA/EPA的南极磷虾油具有改善骨质疏松和骨性关节炎的作用，但其如何调控BMSCs分化尚未见报道。本研究论文分别从海洋生物资源中分离纯化出DHA-PC和EPA-PC，以大鼠BMSCs为切入点，在in vitro体系中研究了DHA-PC和EPA-PC对BMSCs向成骨细胞分化的影响，并在高糖高脂诱导的肥胖型骨质疏松症小鼠模型中进行了验证，系统地研究了DHA-PC和EPA-PC调控BMSCs促进骨生成的作用机制。主要研究结果如下：<br>　　本论文首先研究了DHA-PC和EPA-PC对前成骨细胞系MC3T3-E1的成骨活性。结果显示，DHA-PC和EPA-PC可以促进MC3T3-E1增殖和矿化钙结节的形成；在ex-vivo体系中，DHA-PC和EPA-PC与乳鼠颅骨新骨共同孵育，结果进一步显示，DHA-PC和EPA-PC能促进乳鼠颅骨新骨生成。利用DHA-PC和EPA-PC饲喂生长期小鼠21天，进一步在in vivo体系中研究DHA-PC和EPA-PC对正常生长期小鼠骨生成的影响，结果表明，DHA-PC和EPA-PC能上调血清骨生成指标BMP2、ALP和OCN的水平，促进骨钙化速率，促进骨生成、抑制骨髓腔内的脂肪生成。以上结果提示，DHA-PC和EPA-PC具有显著的促进成骨和抑制成脂活性，DHA-PC和EPA-PC相比较，DHA-PC的效果优于EPA-PC。<br>　　BMSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。本文进一步采用全骨髓贴壁法从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞，研究了DHA-PC和EPA-PC对BMSCs增殖和分化的影响。结果显示，DHA-PC和EPA-PC可以促进BMSCs的增殖，且具有时间-剂量依赖效应关系。在成骨诱导分化和从脂肪细胞向成骨细胞转分化条件下，茜素红染色结果表明，DHA-PC和EPA-PC可以显著促进矿化钙结节形成；在成脂诱导分化和从成骨细胞向脂肪细胞转分化条件下，油红O染色结果表明，DHA-PC和EPA-PC可以显著抑制脂滴形成；分子生物学分析结果显示，无论在成骨或成脂诱导条件下，DHA-PC和EPA-PC均可以提高成骨分化标志基因ALP、COI-Ⅰ和OCN的表达，抑制成脂分化标志基因ap2和Glut4的表达。上述结果提示DHA-PC和EPA-PC可以促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化，DHA-PC的效果优于EPA-PC。<br>　　经典的Wnt/β-catenin信号传导通路在调节BMSCs的分化命运中起关键作用。q-PCR和Western Blot分析结果表明，DHA-PC和EPA-PC可以显著上调Wnt10b，LRP5、β-catenin、Runx2和Osx等关键基因mRNA和蛋白表达量，促进GSK-3β的磷酸化水平，增加β-catenin入核和核内表达量。提示DHA-PC和EPA-PC通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs向成骨细胞分化，DHA-PC的效果优于EPA-PC。<br>　　已有研究证明DHA/EPA是PPARγ的激动剂，PPARγ磷酸化对BMSCs向成骨成脂分化有重要影响。本论文以PPARγ的完全激动剂RSG为阳性药，研究了DHA-PC和EPA-PC对骨生成的作用是否与PPARγ有关。实验结果表明，无论在成骨或成脂诱导培养条件下，RSG都显著上调PPARγ总蛋白的表达，抑制Ser112PPARγ的磷酸化，而DHA-PC和EPA-PC对总PPARγ蛋白表达没有显著性影响，却可以促进Ser112PPARγ的磷酸化。有关DHA-PC和EPA-PC与PPARγ的作用方式仍需进一步研究。<br>　　采用高糖高脂诱导的肥胖型骨质疏松症模型，验证了DHA-PC和EPA-PC对骨生成的作用。结果表明，DHA-PC和EPA-PC能够显著增加肥胖型骨质疏松症模型小鼠骨密度、促进骨的钙化速率，增加股骨骨小梁的数量，减少骨髓腔脂肪的形成。而RSG则进一步恶化了模型小鼠的上述指标。研究结果验证了DHA-PC和EPA-PC具有促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化的作用。进一步研究了DHA-PC和EPA-PC对模型小鼠骨髓基质干细胞中关键基因Wnt10b、β-catenin、Runx2和Osx的蛋白表达以及Ser112PPARγ磷酸化水平的影响，结果表明，DHA-PC和EPA-PC能够激活Wnt/β-catenin信号转导通路。体内实验结果进一步提示DHA-PC和EPA-PC具有显著促进骨生成的作用。<br>　　营养功效因子通过肠-骨轴改善骨质疏松症已逐渐成为研究热点。本文分别采用双侧去卵巢和高糖高脂诱导的骨质疏松症模型小鼠，研究了DHA-PC和EPA-PC对骨质疏松症模型小鼠肠道菌群结构的影响。实验结果表明，两种骨质疏松症小鼠模型均可造成小鼠肠道菌群结构发生明显变化，DHA-PC和EPA-PC的干预可显著改善肠道菌群结构。在去卵巢骨质疏松模型中，DHA-PC和EPA-PC可以极大增加肠道中毛螺菌、乳酸杆菌和梭菌的丰度。在肥胖型骨质疏松模型中，DHA-PC和EPA-PC可以极大增加肠道中拟杆菌和乳酸杆菌的丰度，这些菌群与骨生成具有正相关的关系。<br>　　本论文首次以BMSCs为切入点，在in vitro和in vivo水平上系统地研究并证明了DHA-PC和EPA-PC能够促进BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化，其作用基质与激活Wnt/β-catenin信号转导通路及上调Ser112PPARγ磷酸化水平有关。同时DHA-PC和EPA-PC显著增加了肠道中毛螺菌、乳酸杆菌、梭菌和拟杆菌的丰度，改善了菌群结构。研究结果为DHA-PC和EPA-PC的深度开发利用以及改善骨质疏松症的新型食品药品开发提供了理论基础和科学依据。