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摘要唾液酸是一类以9碳单糖为骨架的神经氨酸衍生物，在生物体内以不同方式连接于蛋白质或糖类等物质，从而发挥重要的生物功能，多项研究证明，唾液酸类物质在提高免疫力、抗炎抗病毒、预防老年痴呆和促进婴幼儿大脑发育等方面具有重要作用。鱼卵，作为水产品加工的副产物之一，除少数得到优质利用外，绝大部分被直接废弃或用作饲料原料，造成了大量天然资源的浪费。通过活性追踪方法发现鱼卵中唾液酸糖蛋白可有效促进成骨细胞的增殖，本文则系统地研究了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(SialoglycoproteinsisolatedfromCarassiuaauratusegg，Ca-SGP)对前成骨细胞MC3T3-E1分化的调控及作用机制，主要研究结果如下：<br>　　采用MTT法和流式细胞术研究了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对MC3T3-E1细胞增殖作用和细胞周期的影响。MTT结果显示，Ca-SGP可显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，且呈现时间-剂量依赖性，96h时40μg/mLCa-SGP对细胞的增殖率可达44.53%。流式细胞仪测定细胞周期的结果显示，Ca-SGP可明显增加细胞周期S期和G2/M期所占的比例，相比于正常对照组，Ca-SGP组S期和G2/M期百分比之和增加了7.35%，具有显著差异性，提示Ca-SGP可能通过推动细胞周期进程促进MC3T3-E1细胞的增殖。采用β-甘油磷酸和抗坏血酸诱导MC3T3-E1细胞分化及矿化，研究Ca-SGP对细胞分化作用的影响。结果显示，Ca-SGP在MC3T3-E1细胞分化过程中可显著增加ALP活性；ELISA结果表明，Ca-SGP对细胞分化中后期标志性蛋白OPN、COLⅠ和OCN的合成分泌有明显的增加作用，可分别提高17.79%、43.55%和16.14%(Plt;0.01)；茜素红染色表明，Ca-SGP可明显增加骨基质的沉积和矿化钙结节的形成，其促进作用可高达312.11%。进一步采用新生鼠颅骨ex-vivo培养体系研究了Ca-SGP在骨微环境下对骨形成的作用效果。结果显示，Ca-SGP作用后，可明显增加钙离子的摄入量及成骨细胞的数量和活性，促进颅骨新骨形成，Hamp;E染色结果显示，Ca-SGP作用组新骨形成厚度明显高于正常对照组。综上所述，Ca-SGP对成骨细胞的增殖、分化和矿化有良好的作用效果，能够有效促进由成骨细胞主导的骨形成作用。<br>　　采用qRT-PCR和Westernblot方法研究了Ca-SGP促进MC3T3-E1细胞分化成熟的作用机制。在MC3T3-E1细胞分化过程中添加BMP2/Smads、Wnt/β-catenin和p38MAPK信号通路抑制剂noggin、21H7和SB203580，结果显示，细胞中Runx2、ALP和OCN的mRNA表达量均显著降低，且SB203580的抑制作用最为显著，初步推测，在Ca-SGP促进MC3T3-E1细胞分化过程中，三条通路均发挥重要作用，其中p38MAPK发挥主导作用。研究发现，Ca-SGP可显著促进BMP2/Smads信号通路中BMP2和smad4的mRNA和蛋白表达，明显增加smad1蛋白的磷酸化水平，且作用该通路特异性抑制剂noggin后，Ca-SGP对该通路的激活作用受到一定程度的影响，说明Ca-SGP通过BMP2/Smads信号通路促进MC3T3-E1细胞分化。qRT-PCR结果显示，Ca-SGP可明显促进Wnt/β-catenin信号通路中LRP5、β-catenin和LEF1的mRNA表达，Westernblot结果显示，Ca-SGP可显著增加β-catenin在细胞质中的累积和向核内的转运，作用β-catenin特异性降解药物21H7后，Ca-SGP对细胞的促分化作用受到一定程度的抑制，提示Wnt/β-catenin信号通路也参与了Ca-SGP促进MC3T3-E1细胞的分化作用。研究同样发现，p38MAPK蛋白在Ca-SGP作用MC3T3-E1细胞的过程中明显被激活，SB203580抑制p38MAPK活性后，Ca-SGP对BMP2/Smads和Wnt/β-catenin信号通路的激活作用受到影响，提示Ca-SGP通过激活p38MAPK作用成骨分化的两条关键通路BMP2/Smads和Wnt/β-catenin，进一步调控MC3T3-E1细胞的分化作用。<br>　　综上所述，Ca-SGP可显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化，在新生鼠颅骨ex-vivo培养体系中明显增加成骨细胞的活性和新骨的形成，作用机制可能为通过激活p38MAPK调控BMP2/Smads和Wnt/β-catenin信号通路。研究结果为高值化利用水产品加工副产物鱼卵资源和开发防治骨质疏松症的功能因子提供理论和科学支持。