检索历史 清除

摘要近年来，随着生物工程和蛋白质工程相关理论技术的日新月异的发展，尤其是以分子生物学为基础的基因操作技术和以各种蛋白展示为基础的筛选技术的技术革新，使得作为蛋白质的重要一员的抗体的相关技术获得了突破性的进展，相继出现了传统单克隆抗体、Fab类抗体、scFv抗体以及单域抗体。单域抗体包括驼源VHH（重链抗体可变区）和软骨鱼VNAR（新型抗原受体可变区），它是仅保留了重链可变区的单结构域抗体，其具有分子量更小，特异性更高和免疫原性更低等特点，在检测、诊断、治疗和科研等领域获得了广泛的关注。单域抗体的制备方法可分为两大体系，包括通过免疫动物、建立抗体基因库、分离抗体基因和构建非免疫动物抗体基因库、筛选抗体基因的方法。对于后者，抗体基因库又分为源于动物的天然抗体库、全合成库及二者结合的半合成库。一般地，都须构建一个抗体基因的噬菌体文库（或其它文库），然后从中筛选出特异性高、亲和性好的单域抗体。我国关于单域抗体的研究因受限于研究材料等因素，起步较晚。因此，探索一种不依赖于动物样本的单域抗体全合成可变区基因的噬菌体文库的构建方法是目前亟待解决的课题。<br>　　本研究分别探索了用多步和一步单链DNA连接的方法来构建全合成的骆驼VHHcDNA文库。发现两种连接方法均能获得期待的完整的VHHcDNA文库，且连接效率相似。其中，两步法的中间产物较少，但方法复杂，在构建更长链的cDNA文库时较有优势；一步法的中间产物较多，方法简单，耗时短，能快速地制备得本研究所需的cDNA文库。因此采用一步法连接来构建本实验所需的cDNA文库—VHH-LS。<br>　　采用一步链接法获得全长VHHDNA后，应用含有SfiI和NotI酶切位点的引物、以退火温度为72℃等条件进行PCR，成功获得含有SfiⅠ和NotⅠ酶切位点的VHH-LS特异性扩增产物。同时，应用大肠杆菌TG1将pCantab5e噬菌粒载体进行扩增、将含酶切位点的VHH-SN和pCantab5e分别用SfiⅠ和NotⅠ-HF限制性内切酶进行双酶切，将目的片段纯化后进行连接获得了重组噬菌粒PV。经酶切和PCR验证，结果表明构建的重组噬菌粒较为成功，荧光定量PCR测得PV的浓度为18.20±2.25nM，体积为200μL，多样性高，可用于构建噬菌体文库。<br>　　最后，将制备的重组噬菌粒PV通过电转化导入大肠杆菌TG1中；总计转化了40次使得总得库容量达3.2×107。对挑取的克隆进行PCR鉴定，有效克隆率为98%。挑取18个单克隆进行测序鉴定，比对分析结果表明框架区序列与设计的序列相符合，CDR3区的的序列均不相同，表明构建的文库多样性好，文库质量高。用辅助噬菌体对甘油菌文库进行救援，制备得到噬菌体抗体文库，经滴度测定，为1.2×1011pfu/mL，可用于后续的筛选。<br>　　总之，本研究通过单链DNA连接的方法制备了全合成的骆驼单域抗体VHH的cDNA文库，并与噬菌粒载体pCantab5e重组，电转化到大肠杆菌TG1中，经噬菌体救援后制备了基于骆驼的全合成的单域抗体噬菌体文库，并对该文库进行了初步评价。