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摘要真菌次级代谢产物种类繁多，结构新颖多样，其中很多化合物有着重要应用。对人类有益的化合物，例如抗生素、免疫抑制剂等可用于制药；对人类有害的真菌毒素等，可通过检测其含量来保证食品安全和人类健康。尽管目前人们已研究清楚了一些真菌天然产物以及其生物合成途径、调节机制等，但近年来数以百计的真菌基因组测序表明这些“已知”只是冰山一角。在实验室培养条件下，大量真菌次级代谢产物生物合成基因簇处于“沉默”状态而不表达，真菌产生次级代谢产物的能力未能得到充分体现。因此，本文采用三种分子生物学手段对多株真菌开展对潜在“沉默”基因的功能挖掘研究。<br>　　1.利用同源重组敲除HDAC基因的方法，对海洋来源真菌黄柄曲霉AspergillusflavipesKLA03进行沉默基因挖掘。菌株KLA03是实验室保藏并测序的一株胶州湾海洋沉积物来源真菌，能够产生系列骨架新颖的开链细胞松弛素类化合物，目前本实验室共分离得到25个该类化合物，具有抗肿瘤药物先导结构的优势。通过对其基因簇进行分析，发现KLA03中存在大量潜在次级代谢合成基因。通过LocalBLAST比对分析，确定菌株KLA03里的HDAC基因，进而构建打靶质粒pKO35-1、pKO35-2、pKO48，转入黄柄曲霉A.flavipesKLA03野生菌株原生质体中，分别对其对应的HDAC进行基因敲除，获得5株表型变化的突变株kla35-2-8/10/20、kla48-20/22。在大米培养基静置40天条件下，与野生型相比kla35-2-10有新的化合物峰出现。经过发酵后分离制备化合物，得到两个化合物trichodermamideA和trichodermamideB，这两个化合物在同等培养条件下相同培养基的野生菌株发酵产物中未检测到。<br>　　2.利用异源表达方法，对真菌米曲霉AspergillusoryzaeRIB40沉默聚酮合酶基因HR-PKS功能挖掘。选取AspGD数据库中预测的HR-PKS基因AO090102000166作为目标基因，构建含有目标序列的整合型异源表达质粒pDH4001。将表达质粒转化至营养缺陷型异源宿主AspergillusnidulansA1147中，再通过回补标记基因筛选和PCR检测，证明异源表达质粒成功整合入宿主基因组，得到营养回复重组菌株4株。多种培养条件发酵后，通过LC-MS分析回复突变株的代谢产物，发现AN166-1重组株在PDA培养基上培养9天时有新的化合物峰出现。<br>　　3.利用全局性调控因子LaeA过表达的方法，调控两株深海来源真菌AspergillussydowiiHDN06076和PenicilliumchrysogenumHDN06072中沉默基因簇。菌株HDN06076和菌株HDN06072是两株实验室保藏的深海来源真菌，通过抗性实验，发现这两株真菌对博来霉素具有敏感性，适合进行原生质体转化。使用pBARGPE1作为质粒载体，过表达载体pDH4004、pDH4006。pDH40006质粒的laeA来源构巢曲霉，pDH4004质粒的laeA来源黄柄曲霉A.flavipesKLA03；将pDH40006质粒转入野生株HDN06076，经过筛选得到7株正确的的过表达菌株。通过多种培养条件发酵和LC-MS检测，发现菌株LaeAAN1-13-2在真菌2号固体培养基上培养4天时，其发酵粗提物中有新的化合物吸收峰，且其它化合物产量有明显提高。同样方法，用过表达质粒pDH4006转化野生株HDN06072，得到11个单克隆转化株。通过LC-MS检测发现突变菌株LaeAAN2-7在真菌2号固体和沙氏培养基上培养11天，发酵粗提物中有新的化合物吸收峰，且其它化合物产量有明显提高；pDH4004转化野生株HDN06076的突变菌株未检测到产物变化。<br>　　真菌次级代谢产物是天然药物的重要来源，挖掘真菌潜在次级代谢合成基因簇对于发现新化合物有着重要意义。本文结合国内外真菌次级代谢产物生物合成基因簇的现状，利用分子生物技术，研究真菌次级代谢产物合成基因簇的激活。海洋来源真菌黄柄曲霉A.flavipesKLA03因强大的生产次级代谢产物能力而受到本实验室关注，本课题组对其进行基因组测序发现该菌株内有大量潜在基因簇。本实验主要采用同源重组法敲除KLA03的HDAC基因的方法，对该海洋真菌次级代谢产物的沉默基因激活方法进行初步探索。本实验室前期对米曲霉A.oryzae沉默NR-PKS功能基因簇的研究作了初步探索，本文继续采用异源表达的方法，将米曲霉的一个HR-PKS基因转入构巢曲霉中以阐述该基因的基因功能，为该方法用于海洋真菌基因簇功能挖掘研究提供实验依据。本课题组在对天然产物长期的研究过程中，积累了大量的深海来源真菌。通过传统发酵方法并不能得到新颖的天然产物，且这些菌株粗浸膏显示对人白血病细胞K562活性抑制。通过抗生素敏感性实验，筛选出适合进行遗传操作的菌株。采用过表达全局性调控因子LaeA的方法，观察筛选真菌的产物变化，探究LaeA对真菌次级代谢产物基因簇的影响，对深海来源真菌的潜在沉默次级代谢生物合成基因作出初步探索。