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摘要多酚氧化酶存在于人、动植物及微生物细胞中，是生物体合成黑色素的关键酶，过量的黑色素会导致人患有色素沉着性疾病、果蔬褐变及虾体黑变等，严重影响人的美观、食品的品质及货架期，降低或抑制多酚氧化酶的活性成为近年来研究的热点，相比于传统的物理、化学方法，新兴的生物抑制方法能够更加安全有效的抑制其活性。随着传统抗体在性能、分子量上的劣势愈发明显，新兴的第三代基因工程抗体在检测、医疗及食品领域受到了广泛的关注和应用。20世纪末，科学家从骆驼科和软骨鱼类的血清中发现缺失轻链的重链抗体，又通过基因工程技术得到了仅保留重链可变区的单结构域抗体，称为单域抗体。相比于Fabs、scFv等抗体，驼源VHH（重链抗体可变区）和软骨鱼VNAR（新型抗原受体可变区）的分子量更小、特异性和稳定性更强、免疫原性更低，具有更加广阔的应用发展前景。噬菌体展示技术自发明以来，一直作为抗体筛选及制备的关键技术，构建的噬菌体文库主要分为免疫、天然和合成抗体库，通过筛选得到最优的噬菌粒及抗体基因型，再经过克隆表达技术得到单域抗体。目前，我国已在驼源单域抗体的制备及研究中取得初步进展，尚未发现国内对于鲨源单域抗体制备及性能研究的报道，因此，本课题利用噬菌体展示技术构建多酚氧化酶鲨源单域抗体的免疫文库，并通过淘选及克隆表达技术得到鲨源单域抗体。<br>　　以多酚氧化酶为抗原免疫铰口鲨，提取脾脏RNA并进行反转录，以cDNA为模板扩增得到鲨源单域抗体的目的基因，使用限制性内切酶NcoⅠ和NotⅠ分别酶切目的基因和pHEN2质粒后连接形成重组质粒，经过电转化导入TG1大肠杆菌中，构建起噬菌体文库并验证其转化效果。通过三次免疫，铰口鲨产生高效免疫应答，血浆效价达到1：10000，提取高质量RNA后扩增得到片段为350bp的目的基因，通过基因工程技术得到重组质粒并经过电转化得到库容量为3.2×107的噬菌体文库，随机挑取20个克隆子进行鉴定及测序鉴定，确定文库的有效克隆率为100%。<br>　　将辅助噬菌体M13K07侵染噬菌体文库，得到从宿主菌释放出的噬菌粒，经过三轮抗原浓度为100、10、1μg/mL的淘选后，进行多克隆噬菌体ELISA对淘选结果的验证，单克隆噬菌体ELISA对噬菌粒特异性的验证，确定特异性最强的噬菌粒及其对应的目的基因序列。经过辅助噬菌体的侵染，得到了库容量为1.4×1013pfu/mL的鲨源噬菌粒文库，三轮淘选结果经多克隆噬菌体ELISA验证，吸光值OD450逐轮上升证明特异性噬菌粒得到富集，单克隆噬菌体ELISA及验证实验确定出特异性最强的噬菌粒及其对应的基因序列。<br>　　选择合适的克隆表达系统，利用基因工程技术构建包含目的基因的重组质粒，导入宿主菌进行克隆表达，探索最佳诱导表达条件并利用镍离子金属亲和层析柱进行蛋白纯化，确定最佳咪唑洗脱浓度，将洗脱得到的蛋白进行透析纯化，确定蛋白浓度并通过Western Blot验证表达的蛋白为鲨源单域抗体。选择pET-22b质粒为载体、Rosetta（DE3）为宿主菌，成功构建重组质粒并导入宿主菌，确定最佳表达条件为20℃、0.5mM IPTG，确定咪唑最佳洗脱浓度为50mmol/L，得到蛋白浓度为0.46mg/mL，Western Blot结果验证表达得到的蛋白为多酚氧化酶鲨源单域抗体。