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摘要二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid，DHA）是一种具有抗炎、保护心脑血管、促进视觉细胞和神经系统发育等重要生理功能的n-3多不饱和脂肪酸。裂殖壶菌（Aurantiochytriumlimacinum）作为一种富含DHA的海洋真菌，具有DHA含量高、发酵周期短、无毒害等优点，已成为获取DHA的新兴理想来源。因此研究裂殖壶菌DHA的合成途径和脂肪酸代谢机制，以提高DHA产量具有十分重要的意义和广阔的应用前景。<br>　　本文以裂殖壶菌A.limacinumOUC168为研究对象，首先探究了外源添加剂对裂殖壶菌DHA合成的影响，结果显示，添加400mg/L柠檬酸组的生物量比对照组提高了18.98%，DHA含量比对照组提高了11.99%；添加0.3mg/L生物素组的生物量比对照组提高了14.98%，DHA含量比对照组提高了5.79%。说明添加柠檬酸和生物素均能够促进裂殖壶菌的生长和DHA合成。为了进一步探究柠檬酸和生物素对裂殖壶菌DHA合成的影响机制，我们对裂殖壶菌进行转录组测序，通过对相关通路进行差异基因分析，发现在柠檬酸诱导条件下，磷酸果糖激酶（pfk）、丙酮酸激酶（PK）明显下调，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）明显上调，说明添加适量柠檬酸可以减弱糖酵解途径代谢流量，从而增强磷酸戊糖途径，NADPH的产生也随之增加，为合成脂肪酸提供还原力。生物素诱导条件下，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、PK也呈现下调，脂肪酸合酶（FAS2）呈现明显上调，而生物素是乙酰-CoA羧化酶的辅酶，说明添加生物素后，乙酰-CoA更多的流向脂肪酸合成代谢通路。然后我们选取PKS途径的5个酶域及酰基载体蛋白（ACP）进行荧光定量检测验证，发现在柠檬酸或生物素诱导条件下，基因的变化趋势较为一致，烯脂酰-ACP脱水异构酶（DH）、酮脂酰-ACP还原酶（KR）酶域和ACP明显上调，其余酶域呈现下调，说明DHA合成的增加与PKS途径的这几个酶域的上调表达密切相关，推测是加速了脂肪酸合成的缩合及加氢还原步骤。<br>　　酰基载体蛋白（ACP）是脂肪酸合成过程中的重要蛋白，在添加诱导剂的转录分析中，ACP上调表达，表明其与DHA合成的增加密切相关，为了研究裂殖壶菌中ACP的功能，本文对acp基因进行了缺失突变。将acp基因上游和下游各200bp分段克隆到pTEF1/Zeo载体上得到pTEF1/Zeo-ACP，利用两段acp基因作为同源臂，通过电转化将质粒pTEF1/Zeo-ACP导入裂殖壶菌，得到acp基因敲除菌株（A.limacinumacp-）。对敲除菌株的总脂含量和脂肪酸组成进行了测定，结果表明，A.limacinumacp-总脂含量比A.limacinum下降了35.71%，尤其是不再产生DHA和二十二碳五烯酸（DPA），这些结果表明ACP在裂殖壶菌脂肪酸合成中具有至关重要的作用。<br>　　为探究pks1和pks3基因5’端上游序列的启动子活性，分别克隆了这两段序列，以绿色荧光蛋白作为报告基因，构建了原核表达载体pACGFP1-1-pks1promoter和pACGFP1-1-pks3promoter，以及真核表达载体pYD1-pks1promoter-GFP和pYD1-pks3promoter-GFP，并分别转化大肠杆菌E.coliBL21和酿酒酵母S.cerevisiaeEBY100，构建了重组菌株BL21-pACGFP1-1-pks1promoter、BL21-pACGFP1-1-pks3promoter以及EBY100-pYD1-pks1promoter-GFP和EBY100-pYD1-pks3promoter-GFP；进一步通过荧光光谱检测及SDS-PAGE分析重组菌株的绿色荧光蛋白表达情况。结果显示，这两段5’上游序列能够启动GFP在大肠杆菌E.coliBL21和酿酒酵母S.cerevisiaeEBY100中实现异源表达，说明pks1promoter和pks3promoter两段序列具有启动活性，但是蛋白表达量并不高，表明这两段序列的异源启动活性较弱。本研究为裂殖壶菌的基因工程操作提供了可能的启动子元件。<br>　　本论文通过转录组测序初步研究了裂殖壶菌脂肪酸合成途径相关基因在不同调控因子下的转录水平，并通过基因敲除研究了ACP的功能，通过绿色荧光蛋白研究了启动子的活性，为基因工程改造裂殖壶菌获得高产DHA的菌株奠定了实验基础。