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摘要人角膜内皮（HumanCornealEndothelium，HCE）由单层扁平的规则六角形细胞镶嵌而成，是角膜与房水之间渗透性屏障，对于维持正常视敏度及角膜的厚度和透明度起到关键的作用。足够高的角膜内皮细胞密度（CornealEndothelialCellDensity，ECD）对于维持HCE的生理功能至关重要。但遗憾的是，HCE细胞在人成年后失去了增殖的能力，同时还以每年0.3%~0.6%的速率逐年死亡，而局部细胞死亡后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补细胞缺损区。此外，机械眼外伤、白内障与青光眼等眼内手术、眼内炎症及其它病理因素等均可加速HCE细胞的死亡速率。一旦ECD低于维持角膜内皮生理功能之临界密度后就会引起不可逆的病变，即HCE细胞功能失代偿（CornealEndothelialCellFunctionalDecompensation），导致大泡性角膜病变（BullousKeratopathy），进一步发展便会导致角膜内皮盲。捐献角膜的内皮/组织工程人角膜内皮（Tissue-EngineeredHumanCornealEndothelia,TE-HCE）利用后弹力层角膜内皮移植（DescemetMembraneEndothelialKeratoplasty，DMEK）可有效治疗角膜疾病，但实验室研究数据表明，利用TE-HCE进行角膜内皮缺损动物DMEK移植后，3d内ECD呈显著下降趋势，3d以后ECD逐渐恢复稳定。然而，一旦这时受到急性高眼压（AcuteOcularHypertension,AOH）和慢性高眼压（ChronicOcularHypertension,COH）胁迫，逐渐稳定的ECD是否会出现再次显著下降，对视敏度和角膜透明度造成何种程度的影响，目前尚未研究清楚。因此，研究和揭示高眼压对TE-HCE移植术后ECD的变化规律及影响作用，对于查清高眼压影响TE-HCE移植术后ECD的细胞与分子机理将具有重要的科学价值，也为术后ECD快速下降的临床干预治疗奠定理论基础。<br>　　本文拟利用自身角膜内皮细胞没有再生能力的家猫作为动物模型，在进行TE-HCE的DMEK手术后，分别通过前房灌注生理盐水和注射2％甲基纤维素的方法建立AOH和COH模型，对ECD、角膜厚度、角膜透明度和眼压进行了在体跟踪检测，进而对ECD、角膜组织结构、细胞单层的完整性和功能蛋白的表达以及细胞的超微结构进行了离体鉴定，旨在揭示术后高眼压对DMEK术后TE-HCE之ECD、组织结构、角膜内皮细胞形态结构以及角膜内皮功能的影响作用，为进一步研究高眼压对DMEK术后ECD影响作用的细胞与分子机理及其临床干预治疗方法奠定理论基础和研究条件。<br>　　首先，利用TE-HCE的DMEK移植家猫建立了AOH模型。本文利用本实验室体外构建的TE-HCE对刮除角膜内皮的家猫进行了DMEK手术，于术后3d向家猫术眼的前房中灌注生理盐水，10min内IOP分别升高至30mmHg和50mmHg，且能稳定维持至少6h，成功建立了两种AOH模型。<br>　　其次，利用所建立的家猫AOH模型，分别研究了30mmHg和50mmHgAOH持续不同时间对角膜内皮ECD、组织结构、角膜内皮细胞形态结构以及角膜内皮功能的影响作用。本文分别在30mmHg和50mmHgAOH模型建立的2h、4h和6h后，使用裂隙灯显微镜、角膜测厚仪和角膜内皮镜对角膜透明度、角膜厚度和ECD进行了在体的跟踪检测，发现30mmHg和50mmHgAOH均能显著引起角膜厚度增加（水肿）且与IOP值和持续时间呈正相关；同时，30mmHg和50mmHgAOH均能显著引起角膜透明度和ECD值的显著降低，且降低幅度也与IOP值和持续时间呈正相关；在体检测结果表明，AOH能够压力值和时间依赖性地引起ECD值的显著下降，致使角膜水肿和透明度降低。处死动物后对角膜内皮的DAPI染色结果发现，30mmHg与50mmHgAOH确能引起ECD值的显著降低；茜素红染色结果进一步证明，30mmHg与50mmHgAOH不仅显著降低了ECD值，而且还出现了局部内皮细胞的丢失和细胞连接的丢失；对角膜内皮面的扫描电镜观察结果显示，30mmHg与50mmHgAOH均能引起部分角膜内皮的面积显著变大，微绒毛数量减少，局部细胞之间的细胞连接丢失，且局部出现了细胞解体；石蜡切片HE染色结果显示，30mmHg与50mmHgAOH均能显著引起角膜厚度增大、组织结构水肿松散；透射电镜的观察结果发现，30mmHg和50mmHgAOH均能引起角膜内皮的超微结构发生紊乱，细胞中出现空泡，线粒体肿胀，细胞和细胞核均发生了不同程度的皱缩，细胞之间及细胞与后弹力层之间的细胞连接发生了不同程度的破坏，甚至染色质出现了不同程度的凝缩；冰冻切片免疫荧光检测发现，30mmHg和50mmHgAOH均能引起角膜内皮细胞对紧密连接蛋白ZO-1和载体蛋白Na+/K+-ATPase表达的显著下降；上述离体鉴定结果，均具有IOP值和持续时间的依赖性。上述30mmHg和50mmHg两种AOH模型的在体检测和离体鉴定结果表明，AOH不仅能显著降低DMEK植入TE-HCE的ECD值，而且对角膜内皮细胞的形态结构和功能还具有显著的损伤作用，使角膜内皮细胞单层的屏障功能和膜运输功能受到破坏，最终引起角膜发生水肿和透明度下降。<br>　　再其次，利用TE-HCE的DMEK移植家猫建立了COH模型。本文利用体外构建的TE-HCE对刮除角膜内皮的家猫进行了DMEK手术，于术后3d向家猫术眼的前房中注射2％甲基纤维素，1d后IOP升高至21mmHg以上，且能稳定维持至少60d，成功建立了家猫的COH模型。<br>　　最后，本文分别在COH模型建立1d、30d和60d后，使用裂隙灯显微镜、角膜测厚仪和角膜内皮镜对角膜透明度、角膜厚度和ECD进行了在体的跟踪检测，发现COH30d和60d均能显著引起角膜厚度增加（水肿）且与持续时间呈正相关；同时，COH1d、30d和60d均能显著引起角膜透明度和ECD值的显著降低，且降低幅度也与和持续时间呈正相关；在体检测结果表明，COH能够时间依赖性地引起ECD值的显著下降，致使角膜水肿和透明度降低。处死动物后对角膜内皮的DAPI染色结果发现，COH确能引起ECD值的显著降低；茜素红染色结果进一步证明，COH不仅显著降低了ECD值，而且还出现了局部内皮细胞的丢失和细胞连接的丢失；对角膜内皮面的扫描电镜观察结果显示，COH能引起部分角膜内皮细胞的面积显著变大，微绒毛数量减少，局部细胞之间的细胞连接丢失，且局部出现了细胞解体；石蜡切片HE染色结果显示，COH能显著引起角膜厚度增大、组织结构水肿松散；透射电镜的观察结果发现，COH能引起角膜内皮细胞的超微结构发生紊乱，细胞中出现空泡，线粒体肿胀，细胞和细胞核均发生了不同程度的皱缩，细胞之间及细胞与后弹力层之间的细胞连接发生了不同程度的破坏，甚至染色质出现了不同程度的凝缩；冰冻切片免疫荧光检测发现，COH能引起角膜内皮细胞对紧密连接蛋白ZO-1和载体蛋白Na+/K+-ATPase表达的显著下降；上述离体鉴定结果，均具有COH持续时间的依赖性。上述COH模型的在体检测和离体鉴定结果表明，COH不仅能显著降低DMEK植入TE-HCE的ECD值，而且对角膜内皮细胞的形态结构和功能还具有显著的损伤作用，使角膜内皮细胞单层的屏障功能和膜运输功能受到破坏，最终引起角膜发生水肿和透明度下降。<br>　　综上所述，本文利用DMEK植入TE-HCE的术后家猫先后建立了AOH和COH模型，发现AOH和COH对ECD值、角膜内皮细胞的形态结构和功能、角膜内皮的屏障功能和膜运输功能以及角膜厚度和透明度具有显著的影响作用。本文首次系统研究了AOH和COH对术后ECD的影响作用，所取得的研究结果为进一步研究和揭示角膜移植术后高眼压对ECD影响作用的机理奠定了基础，为临床医师和患者高度重视和尽早预防高眼压对角膜内皮的毒害作用提供了理论依据，对于术后AOH和COH所致ECD显著下降的临床干预治疗也将具有重要的科学意义和指导价值。