检索历史 清除

摘要角膜是位于眼球表面最前端的一种高度特化的透明组织，能够提供约70%的屈光能力，其透明性和一定的曲率保证了光线的无损通过和准确聚焦，在形成和维持我们的视功能方面至关重要。其中，位于角膜最表面的人角膜上皮（humancornealepithelium，HCEP），从表面外胚层发育而来，由多层鳞状上皮细胞、多层翼状上皮细胞和单层柱状上皮细胞组成，在保护角膜和提供角膜屈光能力方面又发挥有无法替代的重要作用。物理化学损伤或病原体严重感染，均可能会造成角膜上皮的永久性损伤，进而引发角膜混浊和视力丧失。目前，临床上治疗角膜上皮严重损伤疾病的主要方法是进行异体捐献角膜组织的移植。然而，捐献角膜数量的严重不足，已造成能满足患者需求的高质量供体角膜远远供不应求，致使绝大多数角膜上皮疾病患者无法通过角膜移植复明。近年来，随着生物材料的可调节性和仿生设计水平等的日益进步，利用从活体组织中分离出来进行体外扩增培养的种子细胞，接种至生物相容性良好的载体支架上，体外构建而成的可作为天然角膜替代物的组织工程人角膜上皮（tissue-engineeredhumancornealepithelium，TE-HCEP），便成为了治疗角膜上皮严重损伤的希望之光。<br>　　属性与功能均正常的种子细胞以及生物相容性良好、可大批量生产的载体支架是实现TE-HCEP工厂化生产的必要条件。本实验室首次建立的无致瘤性、非转染的人角膜上皮细胞（HCEP）系解决了TE-HCEP中的种子细胞问题；目前用于制备TE-HCEP载体支架的材料中，天然生物材料如羊膜、脱细胞前板层等。虽然生物相容性理想但存在潜在病原体携带风险和宗教伦理问题，人工高分子材料如聚乙二醇（PEG）化合物等虽然机械性能较好但生物相容性欠佳，而天然生物大分子材料中的胶原蛋白具有生物相容性佳、免疫原性低、无潜在传染疾病的风险、不存在宗教伦理问题等优点，最重要的是胶原的来源广泛、适合于规模化提取，而且肌腱等来源的I型胶原又是角膜前弹力层的主要天然组分，使以其为材料规模化制备角膜载体支架成为可能。但遗憾的是，使用胶原蛋白制备出的载体支架仍然存在有机械性能较差、不耐手术缝线牵拉且分子分布和走向不均一等缺陷，在很大程度上限制了其在载体支架规模化生产中的应用。<br>　　为解决以胶原蛋白为材料批量化制备载体支架中机械强度不足和走向分布不均的问题，本文选取牛跟腱为原料提取完整肽链的I型牛胶原蛋白（bCOL）分子，通过研究建立bCOL复合膜支架制备的最佳技术工艺，制备出理化性质和生物相容性良好的bCOL复合膜支架，接种非转染人角膜上皮组织细胞后，经过“气-液”界面培养进行TE-HCEP的体外构建及其结构和功能鉴定的研究，旨在建立前弹力层样bCOL复合膜支架的规模化生产工艺，体外构建出可以作为角膜上皮替代物的TE-HCEP，用作角膜上皮研究的体外组织模型及用于角膜上皮疾病的移植和治疗。<br>　　具体研究内容包括：<br>　　1．bCOL复合膜支架制备工艺的摸索与优化。为了建立载体支架的最佳制备工艺，本文对所提取完整肽链bCOL溶液的搅拌时间、支架的干燥方法和交联条件以及交联剂中硫酸软骨素的添加量进行了优化。首先，对I型bCOL溶液的连续搅拌时间进行了摸索，发现连续搅拌48h胶原蛋白分子分布均匀、分子走向均一。其次，对bCOL膜片的干燥方法进行了优化，分别选用冻干和风干对膜片进行干燥处理，发现风干8h后膜片的透明度和透光性最高、结构完整无裂痕。再次，对EDC/NHS交联剂对bCOL膜片的最适交联条件进行了摸索，发现EDC:NHS的比例为4:1于37℃交联8h，bCOL膜支架的透明度最高。最后，对硫酸软骨素的添加浓度进行了摸索，阿利新蓝染色结果显示，硫酸软骨素的添加浓度为58mg/mL时与天然猪角膜的多糖含量最为相近。由此可见，对bCOL溶液连续搅拌48h、室温自然风干8h、EDC:NHS=4:1于37℃交联8h且添加58mg/mL硫酸软骨素为bCOL复合膜支架的最佳制备条件。按照上述优化方法，将bCOL冻干物溶解于0.01M的盐酸溶液中配制成浓度为20mg/mL的胶原蛋白溶液，经过12h/天、连续4天搅拌，制备出胶原分子有序排列的bCOL溶液，经离心排泡后注入特制模具中成型，置于-80℃冰箱中，制备出厚度为1000μm的牛胶原蛋白膜片，室温风干8h，将膜片浸入EDC:NHS=4:1并添加58mg/mL硫酸软骨素的交联剂溶液中，置37℃交联8h，制备出bCOL复合膜支架。<br>　　2．bCOL复合膜支架的理化性质鉴定。理化性质的鉴定结果表明，所制备出的bCOL复合膜支架透明度高，厚度为66.57±1.27μm，含水量为72.02±2.10%；支架表面平整、内部结构均一、无明显气泡和断裂情况，与天然猪角膜前弹力层相似；支架的弹性模量和抗张强度分别为3.11±0.21MPa和1.82±0.14MPa，虽然与天然猪角膜前弹层有显著差异，但抗牵拉能力仍然很好、能耐受手术缝合线的牵拉，有可能作为机械强度足够、bCOL分布均匀的载体支架用于TE-HCEP的体外构建研究。<br>　　3．bCOL复合膜支架生物相容性的检测与鉴定。bCOL复合膜支架浸提液的MTT检测结果发现，支架浸提液对HCEP细胞的细胞活力没有显著影响，即无毒性作用；光镜观察结果显示，HCEP细胞在bCOL复合膜支架可进行正常的生长增殖；RT-PCR结果证明，HCEP细胞在接种于支架前后，细胞中生长和增殖相关基因mTOR、CyclinD1以及p16和p27的表达丰度无统计学差异；冰冻切片的HE结果显示，bCOL复合膜支架上的HCEP细胞经“气-液”界面培养3天后能形成3-5层细胞的复层上皮结构，培养至第7天时，形成5-7层细胞的复层结构；新西兰兔的角膜囊袋移植实验的观测结果表明，将bCOL复合膜支架移手术植入兔角膜基质中后，角膜中没有出现新生血管，也没有发现明显的炎症和免疫排斥反应，支架植片逐渐变为透明，术后60天取材进行石蜡切片HE染色的结果证实，角膜未出现新生血管，植片中也没有出现炎症细胞。以上结果证明，本文所制备的bCOL复合膜支架具有良好的生物相容性，能作为载体支架用于TE-HCEP的体外构建研究。<br>　　4．基于bCOL复合膜支架的TE-HCEP（bCOL-TE-HCEP）的体外构建及其鉴定。将HCEP细胞接种于bCOL复合膜支架上体外“气-液”界面培养5天，构建出了bCOL-TE-HCEP。对其进行理化性质的鉴定结果表明，bCOL-TE-HCEP的透明度高、透光性较强，与天然角膜上皮相似；冰冻切片HE染色结果显示，bCOL-TE-HCEP的HCEP细胞生长良好，形成了约有7层细胞的复层上皮，细胞间、细胞与支架间连接紧密；免疫荧光检测结果证实，HCEP细胞仍能正常表达其标志性蛋白——角蛋白3/12，细胞连接蛋白——紧密连接蛋白ZO-1、间隙连接蛋白-43和整联蛋白-β1，膜运输载体蛋白——钠钾泵ATP酶，以及抗紫外线蛋白——乙醛脱氢酶3A1，表明支架上的HCEP仍具有角膜上皮组织细胞的正常属性潜在的形成连接蛋白、膜运输和抗紫外线辐射的生物学功能，与天然角膜上皮类似。上述结果证明，利用bCOL复合膜支架体外构建的TE-HCEP，在理化性质、结构与功能属性方面，与天然人角膜上皮相似，有望作为角膜上皮的替代物用于体外组织模型的研究及角膜上皮疾病的临床治疗。<br>　　5．bCOL-TE-HCEP作为体外组织模型的可行性验证。为了验证体外构建bCOL-TE-HCEP能否作为眼科药物毒理学研究的体外组织模型，本文使用bCOL-TE-HCEP研究了抗青光眼药物——噻吗心安的细胞毒性作用。首先通过光镜实验确定了药物浓度为5mg/mL及2.5mg/mL，处理时间为4h；使用5mg/mL、2.5mg/mL的噻吗心安处理bCOL-TE-HCEP4h后细胞活力明显下降，TUNEL检测结果显示，bCOL-TE-HCEP组织模型中的HCEP细胞出现了DNA断裂现象，表明噻吗心安对HCEP细胞具有毒性作用，可能引起HCEP细胞发生凋亡，Caspase检测结果说明噻吗心安确实引起了HCEP细胞的凋亡，同本实验室利用体外细胞模型的前期研究结果相符。初步证明，bCOL-TE-HCEP可作为体外组织模型，用于眼科药物的药理学研究。<br>　　综上所述，本文通过研究和优化bCOL溶液的搅拌时间以及膜片的干燥方法、交联条件和硫酸软骨素的添加量，成功建立了利用完整肽链I型牛胶原蛋白分子制备bCOL复合膜支架的最佳技术工艺，所制备出的bCOL复合膜支架在透明度、机械性能、组织结构和生物相容性方面与天然角膜前弹力层相似，进而以其为载体支架体外构建出了在形态、结构和功能潜能上与天然角膜上皮近似的bCOL-TE-HCEP，并初步证明可作为眼科药物噻吗心安药理学研究的体外组织模型。本文所取得的研究结果，为利用I型牛胶原蛋白规模化生产bCOL复合膜支架创造了条件，从而使TE-HCEP的规模化体外构建成为可能，对于实现bCOL-TE-HCEP在角膜上皮体外组织模型科学研究及角膜上皮疾病临床移植治疗中的广泛应用奠定了基础，具有重要的科学理论意义和临床应用价值。