摘要目的:<br> 本研究通过观察不同剂量硫酸镍(Nickel sulfate,NiSO4)染毒大鼠甲状腺组织自噬相关指标表达水平,以期阐明自噬在镍暴露环境中对大鼠甲状腺组织的影响及意义;检测镍暴露环境下大鼠甲状腺功能和组织形态学的变化,评估NiSO4对大鼠甲状腺功能及组织代谢损伤的毒性效应;通过观察不同浓度NiSO4对体外培养的人源性甲状腺滤泡上皮细胞(Nthy-ori3-1)生长情况的影响,明确NiSO4对人甲状腺细胞造成损伤的剂量效应关系;并通过检测自噬标志蛋白及核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号转导通路的相关分子,探讨NiSO4对甲状腺代谢的影响及可能机制,为预防环境镍暴露造成的甲状腺代谢损伤提供理论依据。<br> 方法:<br> 1.32只SPF级健康雄性Wistar大鼠按照体重分层随机分为4组:正常对照组(生理盐水5mL/kg)、低剂量组(NiSO4溶液2.5mg/kg)、中剂量组(NiSO4溶液5.0mg/kg)和高剂量组(NiSO4溶液10.0mg/kg),每组8只,腹腔注射1次/日,连续40日。采用免疫组织化学法检测自噬标志分子LC3B、Beclin1和p62蛋白的表达;RT-PCR法检测甲状腺组织自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12、LC3B、p62和Beclin1mRNA的表达;并观察不同剂量NiSO4染毒后大鼠甲状腺功能及甲状腺组织形态学变化。<br> 2.本研究采用人Nthy-ori3-1细胞系,通过CCK-8法检测不同浓度NiSO4对Nthy-ori3-1细胞生长的影响,流式细胞仪检测NiSO4对Nthy-ori3-1细胞周期分布的影响,筛选出NiSO4的适宜损伤浓度,构建NiSO4损伤的人甲状腺细胞模型。<br> 3.使用倒置相差显微镜观察NiSO4干预后Nthy-ori3-1细胞在形态学上的变化,透射电镜进一步观察细胞的超微结构,荧光显微镜观察MDC染色后细胞内自噬的发生,应用Western blot检测自噬分子标记蛋白LC3、p62和Beclin1的表达,进而从蛋白质水平检测Nthy-ori3-1细胞自噬水平的变化。<br> 4.分别使用自噬的抑制剂3-MA和自噬的诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)amp;nbsp;联合NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞,调控NiSO4诱导的自噬,采用PI染色检测其对NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞死亡率的影响,应用Annexin V-FITC/PI双染法观察其对NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞凋亡率的影响,并应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达水平,进而探讨NiSO4诱导的细胞自噬与凋亡之间的关系。<br> 5.使用NF-κB p65转录因子测定试剂盒检测NF-κB信号转导通路的活性,并应用Western blot检测NF-κB信号转导通路相关蛋白IκBα、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ及p65的表达水平,探讨NiSO4诱导Nthy-ori3-1细胞自噬的可能调控机制。<br> 结果:<br> 1.与对照组相比,各NiSO4染毒组ATG5mRNA的表达水平明显增高(Plt;0.001);随着NiSO4染毒剂量的增加,p62mRNA表达水平逐渐下降,差异具有统计学意义(Plt;0.001);与对照组相比,ATG7、ATG12、LC3B、Beclin1的mRNA表达水平仅在中、高剂量NiSO4染毒组升高(P lt;0.05)。低剂量NiSO4染毒组LC3B蛋白呈低表达,与对照组LC3B蛋白表达无明显变化,中、高剂量染毒组大鼠甲状腺组织LC3B蛋白呈现高表达;大鼠甲状腺Beclin1蛋白表达水平与mRNA表达水平一致;各NiSO4染毒组p62蛋白的表达均低于对照组,对照组呈现高表达,随着NiSO4剂量的增加,大鼠甲状腺组织p62蛋白的表达逐渐减低。<br> 2.与对照组相比,连续腹腔注射NiSO4溶液40天后,各NiSO4染毒组的大鼠血清FT4浓度均降低(P lt;0.05),但各剂量染毒组间差异无统计学意义(P gt;0.05)。对照组和低剂量染毒组大鼠甲状腺组织切片显示正常的甲状腺结构;中剂量染毒组甲状腺部分滤泡扩张,滤泡上皮增生,间质充血、纤维组织增生明显;高剂量染毒组甲状腺部分滤泡上皮呈柱状增生,部分区域可见乳头样增生,部分滤泡腔内胶质减少,滤泡周边胶质可见上皮细胞吸收空泡,间质散在红细胞。<br> 3.NiSO4抑制Nthy-ori3-1细胞的生长呈现剂量和时间依赖性,随着NiSO4干预时间的延长和干预浓度的增高,细胞活力降低越明显。同时观察到随着NiSO4浓度的增大,细胞变小变圆,不能贴壁而悬浮在培养液中。细胞周期结果显示,高剂量NiSO4可将Nthy-ori3-1细胞的细胞周期阻滞在S期和G2/M期。<br> 4.荧光显微镜下观察,与对照组相比,NiSO4处理组可观察到更强的荧光信号和更多的MDC标记的阳性细胞。透射电镜观察了NiSO4干预后的Nthy-ori3-1细胞的超微结构,NiSO4处理组可见多个、大小不等的细胞内自噬泡。当使用不同终浓度NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后,LC3-II的表达量随着NiSO4浓度的增加而增加;与对照组相比,NiSO4处理组Beclin1蛋白表达水平显著增加,在高剂量NiSO4染毒组差异具有统计学意义(P lt;0.01);p62蛋白表达显著降低,差异均具有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 5.在NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后自噬和凋亡均被激活,使用自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,显著增加了Nthy-ori3-1细胞的死亡率,同时明显地抑制Nthy-ori3-1细胞的生长;3-MA增加了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞的凋亡率;使用3-MA抑制细胞自噬后,NiSO4诱导的Caspase-3蛋白表达进一步升高,Bax蛋白表达没有明显变化,但是Bcl-2/Bax比值下降,差异具有统计学意义(Plt;0.05)。联合使用自噬激活剂Rapa后,降低了Nthy-ori3-1细胞死亡率,提高了Nthy-ori3-1细胞的活力;缓解了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞的凋亡率;使用自噬激活剂Rapa,降低了NiSO4诱导的Caspase-3蛋白、Bax蛋白表达水平,升高了Bcl-2/Bax的比值,差异具有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 6.NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后,核内p65蛋白、p-IκBα、p-IKKβ蛋白的表达量增加。而自噬抑制剂3-MA明显减轻了NiSO4诱导的核内p65蛋白的表达以及磷酸化IKKβ、IκBα的表达,同时3-MA明显抑制了NiSO4诱导的NF-κB转录活性,差异具有统计学意义(Plt;0.001)。NF-κB抑制剂QNZ下调了NiSO4诱导的LC3-II的表达,上调了p62蛋白的表达。<br> 结论:<br> 1.腹腔注射NiSO4可诱导大鼠甲状腺组织发生自噬,导致Wistar大鼠甲状腺组织发生形态学改变,并引起大鼠甲状腺功能异常。<br> 2.NiSO4以剂量和时间依赖性的方式显著抑制Nthy-ori3-1细胞的生长,NiSO4可诱导Nthy-ori3-1细胞发生自噬。<br> 3.NiSO4诱导Nthy-ori3-1细胞死亡时,自噬和凋亡均被激活,自噬是Nthy-ori3-1细胞的适应性反应,促进了细胞的存活,可保护Nthy-ori3-1细胞免于凋亡。<br> 4.NF-κB信号通路的激活可能参与了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞自噬。
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