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摘要目的：<br>　　本研究通过观察不同剂量硫酸镍（Nickel sulfate，NiSO4）染毒大鼠甲状腺组织自噬相关指标表达水平，以期阐明自噬在镍暴露环境中对大鼠甲状腺组织的影响及意义；检测镍暴露环境下大鼠甲状腺功能和组织形态学的变化，评估NiSO4对大鼠甲状腺功能及组织代谢损伤的毒性效应；通过观察不同浓度NiSO4对体外培养的人源性甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori3-1）生长情况的影响，明确NiSO4对人甲状腺细胞造成损伤的剂量效应关系；并通过检测自噬标志蛋白及核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信号转导通路的相关分子，探讨NiSO4对甲状腺代谢的影响及可能机制，为预防环境镍暴露造成的甲状腺代谢损伤提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.32只SPF级健康雄性Wistar大鼠按照体重分层随机分为4组：正常对照组（生理盐水5mL/kg）、低剂量组（NiSO4溶液2.5mg/kg）、中剂量组（NiSO4溶液5.0mg/kg）和高剂量组（NiSO4溶液10.0mg/kg），每组8只，腹腔注射1次/日，连续40日。采用免疫组织化学法检测自噬标志分子LC3B、Beclin1和p62蛋白的表达；RT-PCR法检测甲状腺组织自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12、LC3B、p62和Beclin1mRNA的表达；并观察不同剂量NiSO4染毒后大鼠甲状腺功能及甲状腺组织形态学变化。<br>　　2.本研究采用人Nthy-ori3-1细胞系，通过CCK-8法检测不同浓度NiSO4对Nthy-ori3-1细胞生长的影响，流式细胞仪检测NiSO4对Nthy-ori3-1细胞周期分布的影响，筛选出NiSO4的适宜损伤浓度，构建NiSO4损伤的人甲状腺细胞模型。<br>　　3.使用倒置相差显微镜观察NiSO4干预后Nthy-ori3-1细胞在形态学上的变化，透射电镜进一步观察细胞的超微结构，荧光显微镜观察MDC染色后细胞内自噬的发生，应用Western blot检测自噬分子标记蛋白LC3、p62和Beclin1的表达，进而从蛋白质水平检测Nthy-ori3-1细胞自噬水平的变化。<br>　　4.分别使用自噬的抑制剂3-MA和自噬的诱导剂雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）amp;nbsp;联合NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞，调控NiSO4诱导的自噬，采用PI染色检测其对NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞死亡率的影响，应用Annexin V-FITC/PI双染法观察其对NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞凋亡率的影响，并应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达水平，进而探讨NiSO4诱导的细胞自噬与凋亡之间的关系。<br>　　5.使用NF-κB p65转录因子测定试剂盒检测NF-κB信号转导通路的活性，并应用Western blot检测NF-κB信号转导通路相关蛋白IκBα、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ及p65的表达水平，探讨NiSO4诱导Nthy-ori3-1细胞自噬的可能调控机制。<br>　　结果：<br>　　1.与对照组相比，各NiSO4染毒组ATG5mRNA的表达水平明显增高（Plt;0.001）；随着NiSO4染毒剂量的增加，p62mRNA表达水平逐渐下降，差异具有统计学意义（Plt;0.001）；与对照组相比，ATG7、ATG12、LC3B、Beclin1的mRNA表达水平仅在中、高剂量NiSO4染毒组升高（P lt;0.05）。低剂量NiSO4染毒组LC3B蛋白呈低表达，与对照组LC3B蛋白表达无明显变化，中、高剂量染毒组大鼠甲状腺组织LC3B蛋白呈现高表达；大鼠甲状腺Beclin1蛋白表达水平与mRNA表达水平一致；各NiSO4染毒组p62蛋白的表达均低于对照组，对照组呈现高表达，随着NiSO4剂量的增加，大鼠甲状腺组织p62蛋白的表达逐渐减低。<br>　　2.与对照组相比，连续腹腔注射NiSO4溶液40天后，各NiSO4染毒组的大鼠血清FT4浓度均降低（P lt;0.05），但各剂量染毒组间差异无统计学意义（P gt;0.05）。对照组和低剂量染毒组大鼠甲状腺组织切片显示正常的甲状腺结构；中剂量染毒组甲状腺部分滤泡扩张，滤泡上皮增生，间质充血、纤维组织增生明显；高剂量染毒组甲状腺部分滤泡上皮呈柱状增生，部分区域可见乳头样增生，部分滤泡腔内胶质减少，滤泡周边胶质可见上皮细胞吸收空泡，间质散在红细胞。<br>　　3.NiSO4抑制Nthy-ori3-1细胞的生长呈现剂量和时间依赖性，随着NiSO4干预时间的延长和干预浓度的增高，细胞活力降低越明显。同时观察到随着NiSO4浓度的增大，细胞变小变圆，不能贴壁而悬浮在培养液中。细胞周期结果显示，高剂量NiSO4可将Nthy-ori3-1细胞的细胞周期阻滞在S期和G2/M期。<br>　　4.荧光显微镜下观察，与对照组相比，NiSO4处理组可观察到更强的荧光信号和更多的MDC标记的阳性细胞。透射电镜观察了NiSO4干预后的Nthy-ori3-1细胞的超微结构，NiSO4处理组可见多个、大小不等的细胞内自噬泡。当使用不同终浓度NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后，LC3-II的表达量随着NiSO4浓度的增加而增加；与对照组相比，NiSO4处理组Beclin1蛋白表达水平显著增加，在高剂量NiSO4染毒组差异具有统计学意义（P lt;0.01）；p62蛋白表达显著降低，差异均具有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　5.在NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后自噬和凋亡均被激活，使用自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后，显著增加了Nthy-ori3-1细胞的死亡率，同时明显地抑制Nthy-ori3-1细胞的生长；3-MA增加了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞的凋亡率；使用3-MA抑制细胞自噬后，NiSO4诱导的Caspase-3蛋白表达进一步升高，Bax蛋白表达没有明显变化，但是Bcl-2/Bax比值下降，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。联合使用自噬激活剂Rapa后，降低了Nthy-ori3-1细胞死亡率，提高了Nthy-ori3-1细胞的活力；缓解了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞的凋亡率；使用自噬激活剂Rapa，降低了NiSO4诱导的Caspase-3蛋白、Bax蛋白表达水平，升高了Bcl-2/Bax的比值，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　6.NiSO4干预Nthy-ori3-1细胞后，核内p65蛋白、p-IκBα、p-IKKβ蛋白的表达量增加。而自噬抑制剂3-MA明显减轻了NiSO4诱导的核内p65蛋白的表达以及磷酸化IKKβ、IκBα的表达，同时3-MA明显抑制了NiSO4诱导的NF-κB转录活性，差异具有统计学意义（Plt;0.001）。NF-κB抑制剂QNZ下调了NiSO4诱导的LC3-II的表达，上调了p62蛋白的表达。<br>　　结论：<br>　　1.腹腔注射NiSO4可诱导大鼠甲状腺组织发生自噬，导致Wistar大鼠甲状腺组织发生形态学改变，并引起大鼠甲状腺功能异常。<br>　　2.NiSO4以剂量和时间依赖性的方式显著抑制Nthy-ori3-1细胞的生长，NiSO4可诱导Nthy-ori3-1细胞发生自噬。<br>　　3.NiSO4诱导Nthy-ori3-1细胞死亡时，自噬和凋亡均被激活，自噬是Nthy-ori3-1细胞的适应性反应，促进了细胞的存活，可保护Nthy-ori3-1细胞免于凋亡。<br>　　4.NF-κB信号通路的激活可能参与了NiSO4诱导的Nthy-ori3-1细胞自噬。