摘要目的及意义:绿原酸(Chlorogenicacid,CGA)是一种含有咖啡酸和奎宁酸的酚类化合物,它有重要的免疫调节功能,包括参与抑制炎症、降低细胞和组织的氧化损伤及抑制肝纤维化等。绿原酸可通过调节NF-κB等炎症信号通路抑制M1型巨噬细胞促炎因子的分泌,巨噬细胞是介导免疫应答的关键细胞之一,参与启动炎症和组织修复,糖酵解和氧化磷酸化是巨噬细胞关键的糖代谢途径,糖酵解作为M1型巨噬细胞的主要供能途径,参与巨噬细胞极化重编程。线粒体自噬是维持胞内线粒体数量和功能平衡的关键,研究表明,糖酵解和线粒体自噬是M1型巨噬细胞极化的主要驱动力。我们的前期研究结果发现,PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化,目前,绿原酸是否通过PP2Ac甲基化调节糖代谢和线粒体自噬干预M1型巨噬细胞极化分子机制未见详尽报道。本研究采用THP-1细胞及PBMC体外构建人M1型巨噬细胞极化模型,通过设计特异抑制PP2Ac甲基化等体外细胞实验,研究绿原酸通过PP2Ac甲基化调节糖代谢和线粒体自噬干预M1型巨噬细胞极化的作用分子机制,为绿原酸治疗炎症相关性疾病的治疗提供新的科学理论依据。<br> 方法:1.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化<br> (1)巨噬细胞的极化及分组<br> M0型巨噬细胞组:THP-1细胞经100nM佛波酯(PMA)诱导48h极化为M0型巨噬细胞或PBMC经10ng/mlrhGM-CSF诱导7d为活化M0型巨噬细胞;M1型模型组:M0型经10ng/mL脂多糖(LPS)与20ng/mL干扰素γ(IFN-γ)联合诱导48h极化为M1型巨噬细胞;绿原酸干预组:在M1型巨噬细胞极化同时分别加入不同浓度绿原酸共处理48h。<br> (2)CCK-8检测绿原酸对M1型巨噬细胞活性的影响<br> 在M1型巨噬细胞极化同时分别加入25、50、100、150μg/mL绿原酸干预48h每孔加入10μL的CCK-8(20μg/mL),置于37℃细胞培养箱孵育2h,采用大型酶标仪在450nm处测量各实验组吸光度值。<br> (3)绿原酸对M1型巨噬细胞极化的影响<br> 倒置显微镜观察绿原酸干预M1型巨噬细胞后形态学的改变,采用实时荧光定量PCR检测极化M1型相关基因白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、环加氧酶-2(COX-2)、CXC趋化因子配体10(CXCL-10)、CD14(细菌性脂多糖、LPS的辅受体)和M2型极化标志物甘露糖受体(MRC-1)、白介素10(IL-10)、趋化因子22(CCL-22)、CD16(IgG的低亲和力Ⅲ型Fc受体)的mRNA表达水平。采用中性红法检测绿原酸对M1型巨噬细胞吞噬功能的影响。<br> 2.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化的机制研究<br> (1)绿原酸对极化M1型巨噬细胞糖酵解和氧化磷酸水平的影响<br> 微量法检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞的糖酵解代谢酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)和氧化磷酸化酶丙酮酸脱氢酶(PDH)活性的变化,ATP试剂盒检测细胞内ATP水平的变化。<br> (2)绿原酸对M1型巨噬细胞极化中线粒体及线粒体自噬的影响<br> 利用荧光显微镜及多功能酶标仪分别检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞线粒体膜电位和细胞内ROS水平,并检测线粒体及溶酶体数量的变化;采用激光共聚焦显微镜观察绿原酸干预M1型巨噬细胞溶酶体和线粒体荧光共定位的程度。WB检测绿原酸干预后线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin及VDAC1的表达情况。<br> (3)绿原酸通过PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化<br> WB检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞的PP2Ac甲基化修饰的相关蛋白表达及ABL127协同绿原酸干预M1型巨噬细胞PP2Ac甲基化修饰的相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白表达。实时荧光定量PCR检测ABL127协同绿原酸干预的M1型巨噬细胞后M1极化相关标志物表达,微量法检测ABL127增加PP2Ac甲基化对绿原酸干预的M1型巨噬细胞极化的糖酵解代谢酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)及氧化磷酸化酶丙酮酸脱氢酶(PDH)活性的变化和细胞内ATP水平的变化。<br> 结果:1.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化<br> (1)绿原酸在25μg/mL-100μg/mL以剂量依赖性的方式保护M1型巨噬细胞的活力,且在100μg/mL效果最显著(P<0.01)。<br> (2)M1型模型组细胞大部分细胞灰色不透亮,形态不规则,相关基因标志物TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2、CD14的mRNA表达水平增高,而绿原酸干预组梭形样细胞明显减少,M1型极化相关基因标志物的表达降低,M2型极化相关标志物MRC-1、IL-10、CD16的mRNA表达水平增加,巨噬细胞吞噬功能被抑制,呈剂量反应依赖,差异有统计学意义(P<0.05)。<br> 2.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化的机制研究<br> (1)绿原酸干预糖酵解及氧化磷酸化调控M1型巨噬细胞极化<br> M1型巨噬细胞HK、PK、LDH活性均增加,而PDH活性及ATP水平降低;绿原酸干预后HK、PK、LDH活性均降低,而PDH活性及ATP水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);<br> (2)绿原酸对M1型巨噬细胞极化中线粒体及线粒体自噬的影响<br> M1型模型组巨噬细胞的线粒体数量减少,线粒体膜电位降低,ROS增加,溶酶体数量增加;线粒体自噬蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、VDAC1的表达增加,Parkin和P62表达下降;绿原酸干预后线粒体数量增加,线粒体膜电位增加,ROS水平及溶酶体数量降低,溶酶体和线粒体的荧光共定位也下降,且线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、VDAC1的表达降低,P62和Parkin表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。<br> (3)绿原酸通过PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化<br> 与M1模型组相比,绿原酸干预后总的PP2Ac蛋白表达无统计学差异,而PP2Ac去甲基化、PPME-1表达升高,PP2Ac甲基化、LCMT1表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与绿原酸干预组相比,ABL127增加PP2Ac甲基化,降低PP2Ac去甲基化,促进绿原酸下调的M1型极化相关基因的表达,同时HK、PK、LDH的活性升高,PDH活性及ATP水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。线粒体自噬相关蛋白P62表达降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及PINK1、VDAC1表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。<br> 结论:1.绿原酸抑制M1型巨噬细胞极化相关基因标志物TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2、CD14mRNA表达,降低细胞的吞噬功能,增加了M2型巨噬细胞极化相关基因标志物MRC-1、IL-10、CD16mRNA的表达,诱导M1型巨噬细胞向M2表型转化。<br> 2.绿原酸降低M1型极化巨噬细胞ROS生成,提高线粒体膜电位,减少线粒体氧化损伤,增加细胞内线粒体数量;绿原酸通过PP2Ac甲基化抑制PINK1-VDAC1途径介导的线粒体自噬,降低细胞的糖酵解水平,提高线粒体氧化磷酸化水平,负调控M1型巨噬细胞极化。
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