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摘要目的及意义：绿原酸（Chlorogenicacid，CGA）是一种含有咖啡酸和奎宁酸的酚类化合物，它有重要的免疫调节功能，包括参与抑制炎症、降低细胞和组织的氧化损伤及抑制肝纤维化等。绿原酸可通过调节NF-κB等炎症信号通路抑制M1型巨噬细胞促炎因子的分泌，巨噬细胞是介导免疫应答的关键细胞之一，参与启动炎症和组织修复，糖酵解和氧化磷酸化是巨噬细胞关键的糖代谢途径，糖酵解作为M1型巨噬细胞的主要供能途径，参与巨噬细胞极化重编程。线粒体自噬是维持胞内线粒体数量和功能平衡的关键，研究表明，糖酵解和线粒体自噬是M1型巨噬细胞极化的主要驱动力。我们的前期研究结果发现，PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化，目前，绿原酸是否通过PP2Ac甲基化调节糖代谢和线粒体自噬干预M1型巨噬细胞极化分子机制未见详尽报道。本研究采用THP-1细胞及PBMC体外构建人M1型巨噬细胞极化模型，通过设计特异抑制PP2Ac甲基化等体外细胞实验，研究绿原酸通过PP2Ac甲基化调节糖代谢和线粒体自噬干预M1型巨噬细胞极化的作用分子机制，为绿原酸治疗炎症相关性疾病的治疗提供新的科学理论依据。<br>　　方法：1.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化<br>　　（1）巨噬细胞的极化及分组<br>　　M0型巨噬细胞组：THP-1细胞经100nM佛波酯（PMA）诱导48h极化为M0型巨噬细胞或PBMC经10ng/mlrhGM-CSF诱导7d为活化M0型巨噬细胞；M1型模型组：M0型经10ng/mL脂多糖（LPS）与20ng/mL干扰素γ（IFN-γ）联合诱导48h极化为M1型巨噬细胞；绿原酸干预组：在M1型巨噬细胞极化同时分别加入不同浓度绿原酸共处理48h。<br>　　（2）CCK-8检测绿原酸对M1型巨噬细胞活性的影响<br>　　在M1型巨噬细胞极化同时分别加入25、50、100、150μg/mL绿原酸干预48h每孔加入10μL的CCK-8（20μg/mL），置于37℃细胞培养箱孵育2h，采用大型酶标仪在450nm处测量各实验组吸光度值。<br>　　（3）绿原酸对M1型巨噬细胞极化的影响<br>　　倒置显微镜观察绿原酸干预M1型巨噬细胞后形态学的改变，采用实时荧光定量PCR检测极化M1型相关基因白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、环加氧酶-2（COX-2）、CXC趋化因子配体10（CXCL-10）、CD14（细菌性脂多糖、LPS的辅受体）和M2型极化标志物甘露糖受体（MRC-1）、白介素10（IL-10）、趋化因子22（CCL-22）、CD16（IgG的低亲和力Ⅲ型Fc受体）的mRNA表达水平。采用中性红法检测绿原酸对M1型巨噬细胞吞噬功能的影响。<br>　　2.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化的机制研究<br>　　（1）绿原酸对极化M1型巨噬细胞糖酵解和氧化磷酸水平的影响<br>　　微量法检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞的糖酵解代谢酶己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）和氧化磷酸化酶丙酮酸脱氢酶（PDH）活性的变化，ATP试剂盒检测细胞内ATP水平的变化。<br>　　（2）绿原酸对M1型巨噬细胞极化中线粒体及线粒体自噬的影响<br>　　利用荧光显微镜及多功能酶标仪分别检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞线粒体膜电位和细胞内ROS水平，并检测线粒体及溶酶体数量的变化；采用激光共聚焦显微镜观察绿原酸干预M1型巨噬细胞溶酶体和线粒体荧光共定位的程度。WB检测绿原酸干预后线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin及VDAC1的表达情况。<br>　　（3）绿原酸通过PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化<br>　　WB检测绿原酸干预后M1型巨噬细胞的PP2Ac甲基化修饰的相关蛋白表达及ABL127协同绿原酸干预M1型巨噬细胞PP2Ac甲基化修饰的相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白表达。实时荧光定量PCR检测ABL127协同绿原酸干预的M1型巨噬细胞后M1极化相关标志物表达，微量法检测ABL127增加PP2Ac甲基化对绿原酸干预的M1型巨噬细胞极化的糖酵解代谢酶己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）及氧化磷酸化酶丙酮酸脱氢酶（PDH）活性的变化和细胞内ATP水平的变化。<br>　　结果：1.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化<br>　　（1）绿原酸在25μg/mL-100μg/mL以剂量依赖性的方式保护M1型巨噬细胞的活力，且在100μg/mL效果最显著（P＜0.01）。<br>　　（2）M1型模型组细胞大部分细胞灰色不透亮，形态不规则，相关基因标志物TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2、CD14的mRNA表达水平增高，而绿原酸干预组梭形样细胞明显减少，M1型极化相关基因标志物的表达降低，M2型极化相关标志物MRC-1、IL-10、CD16的mRNA表达水平增加，巨噬细胞吞噬功能被抑制，呈剂量反应依赖，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　2.绿原酸参与调控M1型巨噬细胞极化的机制研究<br>　　（1）绿原酸干预糖酵解及氧化磷酸化调控M1型巨噬细胞极化<br>　　M1型巨噬细胞HK、PK、LDH活性均增加，而PDH活性及ATP水平降低；绿原酸干预后HK、PK、LDH活性均降低，而PDH活性及ATP水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；<br>　　（2）绿原酸对M1型巨噬细胞极化中线粒体及线粒体自噬的影响<br>　　M1型模型组巨噬细胞的线粒体数量减少，线粒体膜电位降低，ROS增加，溶酶体数量增加；线粒体自噬蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、VDAC1的表达增加，Parkin和P62表达下降；绿原酸干预后线粒体数量增加，线粒体膜电位增加，ROS水平及溶酶体数量降低，溶酶体和线粒体的荧光共定位也下降，且线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、VDAC1的表达降低，P62和Parkin表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　（3）绿原酸通过PP2Ac甲基化调控M1型巨噬细胞极化<br>　　与M1模型组相比，绿原酸干预后总的PP2Ac蛋白表达无统计学差异，而PP2Ac去甲基化、PPME-1表达升高，PP2Ac甲基化、LCMT1表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与绿原酸干预组相比，ABL127增加PP2Ac甲基化，降低PP2Ac去甲基化，促进绿原酸下调的M1型极化相关基因的表达，同时HK、PK、LDH的活性升高，PDH活性及ATP水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。线粒体自噬相关蛋白P62表达降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及PINK1、VDAC1表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　结论：1.绿原酸抑制M1型巨噬细胞极化相关基因标志物TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2、CD14mRNA表达，降低细胞的吞噬功能，增加了M2型巨噬细胞极化相关基因标志物MRC-1、IL-10、CD16mRNA的表达，诱导M1型巨噬细胞向M2表型转化。<br>　　2.绿原酸降低M1型极化巨噬细胞ROS生成，提高线粒体膜电位，减少线粒体氧化损伤，增加细胞内线粒体数量；绿原酸通过PP2Ac甲基化抑制PINK1-VDAC1途径介导的线粒体自噬，降低细胞的糖酵解水平，提高线粒体氧化磷酸化水平，负调控M1型巨噬细胞极化。