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摘要目的：通过草酸钙（CalciumOxalate,CaOx）晶体干预肾小管上皮细胞（HK-2），探讨CaOx晶体诱导细胞损伤的发生机制。并利用铁死亡（ferroptosis）诱导剂及抑制剂，探究铁死亡在我们构建的肾小管上皮细胞-草酸钙晶体（HK-2-CaOx）反应模型中的作用机制，并分析是否可以通过调控铁死亡来对CaOx晶体诱导的HK-2细胞损伤发挥调控作用。<br>　　方法：使用配制CaOx晶体悬浊液干预HK-2细胞，构建HK-2-CaOx反应模型，采用7组不同浓度的CaOx晶体(0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0mmol/L)干预HK-2细胞24小时，干预完成后提取HK-2细胞蛋白，并用浓度为4.0mmol/L的CaOx晶体干预HK-2细胞，在不同的时间点(0,3,6,9,12,24,48h)提取细胞蛋白，并通过蛋白质印迹法检测各组细胞内铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。同时应用铁死亡诱导剂爱拉斯汀(Erastin)和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)干预HK-2细胞24h以调控细胞内铁死亡水平。按实验设计要求，将HK-2细胞随机分为成4个组：正常对照组（NC；无干预处理，单纯使用完全培养基培养）；草酸钙晶体刺激组（CaOx；使用含4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养）；草酸钙晶体+Erastin处理组（CaOx+Erastin；使用含10.0umol/LErastin及4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养）；草酸钙晶体+Ferrostatin-1处理组（CaOx+Fer-1；使用含1.0umol/LFer-1及4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养）。24h后，采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和免疫荧光技术分析铁死亡相关蛋白GPX4、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)在肾小管上皮细胞内的表达情况；利用透射电子显微镜观察细胞器形态学改变；利用试剂盒检测HK-2细胞内丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的含量；采用总超氧化物歧化酶（SOD）酶试剂盒检测肾小管上皮细胞总超氧化物歧化酶的酶活力；采用DCFH-DA荧光染色法观察肾小管上皮细胞内细胞活性氧(ROS)表达情况，通过上述方法探究铁死亡在细胞-晶体反应模型中的发生机制及作用。通过光学显微镜观察各组HK-2细胞内CaOx黏附情况、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细胞上清液中LDH的表达水平、DAPI染色检测HK-2细胞细胞核损伤状况。以探究铁死亡在草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤中的调控作用。<br>　　结果：在CaOx晶体干预HK-2细胞的过程中，随着CaOx晶体干预浓度及时间的增加，铁死亡标志蛋白GPX4的表达水平均逐渐减少，实验结果显示与对照组相比，4mmol/L、8mmol/L的草酸钙晶体干预浓度具有统计学意义（Plt;0.05）。其中与对照组相比，4mmol/L草酸钙晶体刺激组(Plt;0.05)作用细胞24h后细胞内铁死亡相关蛋白GPX4的表达差异较明显，所以选用4mmol/L浓度草酸钙晶体作为最佳浓度干预细胞。另外，与对照组相比干预时间为24h、48h时具有统计学意义（Plt;0.05）。其中24h干预组(Plt;0.05)GPX4的表达差异已较为明显。所以选用24h为草酸钙最适干预时间。使用铁死亡诱导剂爱拉斯汀和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1干预肾小管上皮细胞后，草酸钙晶体诱导的铁死亡的发生水平出现明显改变，与正常对照组相比，CaOx晶体诱导HK-2细胞GPX4、SLC7A11蛋白表达量显著降低（Plt;0.05），ACSL4蛋白表达量显著上升（Plt;0.05）。在加入铁死亡保护剂Fer-1后，这一结果受到明显抑制，与单纯草酸钙晶体组相比，同时加入草酸钙晶体及铁死亡保护剂Fer-1后，GPX4、SLC7A11蛋白表达量升高（Plt;0.05），ACSL4蛋白表达量显著降低（Plt;0.05）。与单纯草酸钙晶体组相比，同时加入草酸钙晶体及Erastin后，GPX4、SLC7A11蛋白表达量显著降低（Plt;0.05），ACSL4蛋白表达量显著上升（Plt;0.05）。RT-qPCR结果与蛋白检测结果相一致，实验结果显示:草酸钙晶体刺激组与正常对照组相比，铁死亡相关蛋白GPX4mRNA的表达水平显著降低（Plt;0.05）。草酸钙晶体+铁死亡保护剂Fer-1干预组较草酸钙晶体组的铁死亡标记蛋白GPX4mRNA的表达水平显著增高（Plt;0.05），而草酸钙晶体+铁死亡诱导剂Erastin干预组较草酸钙晶体组的铁死亡标记蛋白GPX4的mRNA的表达水平显著降低（Plt;0.05）。与此同时，草酸钙晶体刺激组与正常对照组相比，铁死亡相关蛋白ACSL4的mRNA表达水平显著升高（Plt;0.05）。草酸钙晶体+铁死亡保护剂Fer-1干预组较草酸钙晶体组的铁死亡标记蛋ACSL4mRNA的表达水平显著降低（Plt;0.05），而草酸钙晶体+铁死亡诱导剂Erastin干预组较草酸钙晶体组的铁死亡标记蛋白ACSL4mRNA的表达水平显著升高（Plt;0.05）。草酸钙晶体刺激组中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽含量明显减少（Plt;0.05），丙二醛含量显著增多（Plt;0.05），细胞内ROS荧光强度增加（Plt;0.05）肾小管上皮细胞内氧化应激水平与铁死亡发生水平呈正相关。与此同时，透射电子显微镜观察到草酸钙晶体干预后HK-2细胞内线粒体形态发生明显改变，草酸钙晶体刺激组较正常对照组相比，细胞内线粒体变小,线粒体膜的膜密度增高,并且出现部分线粒体嵴减少或消失的情况[1]。Ferrostatin-1处理可显著减轻CaOx晶体诱导的HK-2细胞晶体黏附及细胞核的损伤和减少HK-2细胞乳酸脱氢酶的分泌（Plt;0.05），而Erastin处理则进一步加重了HK-2细胞CaOx晶体的黏附、细胞核的损伤和乳酸脱氢酶的分泌（Plt;0.05）。<br>　　结论：通过构建细胞-晶体反应模型，确定了CaOx晶体干预HK-2细胞发生铁死亡反应的最适浓度和时间。CaOx晶体可以通过增加HK-2细胞内氧化应激水平进而诱导HK-2细胞发生铁死亡。应用铁死亡经典诱导剂Erastin及抑制剂Ferrostatin-1能够有效调控肾小管上皮细胞内氧化应激水平，从而调控肾小管上皮细胞铁死亡的发生水平。Ferrostatin-1处理可通过减轻肾小管上皮细胞内铁死亡发生，显著减轻CaOx晶体诱导的细胞损伤，而用Erastin处理则进一步加重了HK-2细胞内铁死亡的发生，CaOx晶体干预后，细胞的损伤也进一步加重。