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摘要目的：Tau蛋白病（Tauopathies）是一组以异常tau蛋白在神经细胞中累积为主要特征的神经退行性疾病，表现为进行性认知功能障碍和脑萎缩。除遗传因素外，环境因素可能对tau蛋白病的病因学至关重要。众多研究强调了重金属通过促进tau磷酸化而增加AD相关tau蛋白病的发病风险。锰（Mn）是一种必需微量金属元素，对人体发育和大脑功能至关重要，由于环境、职业暴露或Mn相关代谢状态改变引起的体内Mn过载通常表现为具有神经毒性，与多种神经退行性疾病关系紧密，表现多样化的运动及认知障碍。在当前Mn神经毒性的研究中，尚不清楚非淀粉样神经病理学是否在锰诱导的神经毒性中起作用，且对于Mn暴露与异常tau磷酸化修饰之间的联系知之甚少，本研究拟通过构建亚慢性、慢性Mn暴露的大鼠模型，探究脑Mn过载对磷酸化tau病理的影响及潜在机制，以及其与Mn诱导进行性认知障碍的联系。<br>　　方法：第一部分1.Mn暴露大鼠模型的建立：将40只8周龄健康SPF雄性SD大鼠随机分为四组，亚慢性（4周）暴露：模型组（4W-Mn组，n=10）和对照组（4W-NC组，n=10），慢性（16周）暴露：模型组（16W-Mn组，n=10）和对照组（16W-NC组，n=10），Mn组大鼠每日腹腔注射15mg/kgMnCl2?4H2O，每周5日，同时，NC组大鼠腹腔注射等量生理盐水，末次给药结束24h后Morris水迷宫（MorrisWaterMaze，MWM）实验用于评价动物空间学习记忆能力缺失，水迷宫实验结束后通过腹主动脉取血、分离海马和皮质区域，ICP-MS法测定全血、海马、皮质中Mn含量以评估内暴露水平；2.HE染色检测海马和皮质区神经元细胞病理变化，Nissl染色检测神经元尼氏体的分布；3.WesternBlot分析检测海马和皮质区Tau-5以及Ser396、Ser404、Ser199、Ser202位点磷酸化Tau（p-tau）蛋白水平，免疫组织化学法（IHC）分析p-tau的组织病理学特征。<br>　　第二部分1.使用氨基酸分析仪检测海马区游离氨基酸（AAs）丰度，使用MetaboAnalyst5.0分析工具中networkExplorer模块构建代谢疾病网络，并基于超几何分布检验（hypergeometrictests）和中介性核心性（betweennesscentrality）实现通路分析，超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法检测海马区SAM和SAH丰度；2.Met干预实验：将40只8周龄健康雄性SD大鼠随机分为四组，亚慢性（4周）暴露干预：Met干预组（4W-Mn/Met组，n=10）和Met对照组（4W-NC/Met组，n=10）；慢性（16周）暴露干预：Met干预组（16W-Mn/Met组，n=10）和Met对照组（16W-NC/Met组，n=10），Mn/Met组大鼠每日腹腔注射15mg/kgMnCl2?4H2O和200mg/kgL-Methionine，每周5日，同时，Met组大鼠腹腔注射200mg/kgL-Methionine和等量生理盐水，HPLC-MS法检测海马区SAM和SAH丰度，MWM实验评价Met的认知保护作用；<br>　　第三部分1.WesternBlot分析检测海马和皮质区LCMT-1、PME-1、Dem-PP2Ac、PP2Ac、S396/p-tau、Tau-5蛋白表达水平；2.免疫组化用于评估脑区中S396/p-tau沉积。<br>　　结果：第一部分脑Mn过载诱导认知障碍中Tau病理改变1.Mn暴露诱导大鼠空间记忆障碍：MWM实验结果显示，在训练期，4W-Mn组大鼠逃避潜伏期仅在第4、5天较4W-NC组延长（p﹤0.05），16W-Mn组大鼠逃避潜伏期在第3、4、5天较16W-NC组显著延长（p﹤0.01），NC组与4W-Mn组大鼠随训练天数增加显示出大幅减少的平均路程，而16W-Mn组大鼠降幅较小；在空间探索期，目标象限路程占比仅在16W-Mn组大鼠中显著降低（p﹤0.05）；ICP-MS分析结果显示，Mn组大鼠血液和海马区Mn含量以暴露时间依赖的方式显著增加（p﹤0.005）。2.Mn暴露诱导大鼠神经退行性变：16W-Mn组大鼠大脑呈萎缩迹象，脑系数呈降低趋势（p=0.081）；同时Nissl染色分析结果显示16W-Mn组大鼠CA1、EC区神经元显著降低（p﹤0.005）。3.Mn暴露诱导大鼠磷酸化tau病理进展：WesternBlot结果显示，4W-Mn组大鼠皮质（p﹤0.05）和海马（p﹤0.05）中S396/p-tau蛋白表达均明显增加，在16W-Mn组大鼠中增加更为显著（p﹤0.005），S404/p-tau表达水平仅在16W-Mn组大鼠海马中显著增加（p﹤0.005），S202/p-tau表达水平在16W-Mn组大鼠皮质中显著增加（p﹤0.05），而S199/p-tau表达水平在各组中均无差异；IHC结果显示，在Mn暴露早期（4W），S396/p-tau在嗅周皮质（PRh）、内嗅皮质（EC）、梨状皮质（PC）以及丘脑的前核（AN）、内侧背核（MD）、腹外侧核（VL）、外侧膝状体（LGN）中的大量神经元阳性胞体，而海马CA1、CA3、DG区可见少量神经元阳性胞体。海马、丘脑相关连接纤维结构海马神经纤维（Alv）、海马旁扣带束（PHC）、乳头体丘脑束（Mtt）、内囊（IC）、髓纹（SM）、终纹（ST）在暴露早期可见少突胶质细胞阳性内含物增加，暴露早期纹状体尾状核（CPu）、外侧苍白球（LGP）、新皮质区视觉皮质（VC）、体感皮质（SSC）不可见S396/p-tau表达；随着暴露时间增加（16W），海马本体以及新皮质VC、SSC区S396/p-tau阳性标记显著上调，纹状体区仍不可见明显的S396/p-tau标记；病理占比半定量后生成的热图反映了Mn暴露诱导p-tau病理有丘脑和横向内嗅区向海马及新皮质扩散的进展模式。<br>　　第二部分脑Mn过载抑制SAM依赖的PP2Ac甲基化1.Mn暴露诱导PP2Ac甲基化相关蛋白表达改变：WesternBlot结果显示，与NC组相比，LCMT-1蛋白表达水平在Mn组大鼠皮质区（16W：p﹤0.05）和海马区（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.01）下调，PME-1在Mn组大鼠皮质区（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.01）和海马区（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.005）上调，Dem-PP2Ac在Mn组大鼠皮质（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.005）和海马区上调（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.005），总PP2Ac无显著变化；2.Mn暴露诱导大鼠海马区SAM丰度下降：氨基酸分析结果显示，与NC组相比，Taurine在4W-Mn以及16W-Mn组大鼠海马区均上调（p﹤0.05），Glu、Asp、Asn丰度在4W-Mn组显著上调（p﹤0.005），Glu、Asp在16W-Mn组中下调（p﹤0.05），Gly、Met在4W-Mn组和16W-Mn组大鼠海马区显著下调（p﹤0.05），Ser在16W-Mn组显著下调（p﹤0.05）；基于数据库（MetPriCNet）对差异AAs构建代谢物（AAs）-疾病网络，交互矩阵显示AD和精神分裂症与Mn暴露后海马区AAs变化具有最强的关联等级，富集分析显示Gly-Ser-Thr代谢、Met代谢可能发生显著变化，UPLC-MS/MS分析显示，SAM丰度以及SAM/SAH比率在4W-Mn组（p﹤0.05）和16W-Mn组（p﹤0.01）大鼠海马区显著下调。<br>　　第三部分Met在高Mn诱导tau过度磷酸化及认知损伤的保护作用1.Met补充通过维持SAM依赖的PP2Ac甲基化阻止tau过度磷酸化：Met干预实验结果显示，相较于Mn组，Mn/Met组海马区SAM丰度、SAM/SAH比率显著上调（4W：p﹤0.05；16W：p﹤0.005），与NC/Met组以及NC组相当；WesternBlot结果显示Mn/Met组与NC/Met组相比，皮质和海马区LCMT-1、PME-1水平、LCMT-1/PME-1比率、S396/p-tau蛋白表达水平均无显著差异。2.Met补充改善Mn诱导的空间记忆障碍：MWM实验显示Mn/Met组与NC/Met组大鼠在逃避潜伏期、平台穿越次数、目标象限搜索时间以及搜寻轨迹上均无显著差异。<br>　　结论：1.S396位点p-tau升高是Mn暴露相关tau病理的早期指标，其病理进展参与了Mn诱导的进行性空间记忆障碍。<br>　　2.S396/p-tau的异常聚集从早期局限于丘脑及横向内嗅区逐渐向海马及新皮质区扩散体现了Mn暴露下tau病理明确的进展模式。<br>　　3.甲硫氨酸补充可通过促进SAM依赖的PP2Ac甲基化，维持高Mn状态下p-tau去磷酸化进程，进而改善空间记忆障碍。