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摘要SCN1A基因编码I型电压依赖型钠通道(Nav1.1)a1亚基，在中枢神经系统广泛表达，其是多种癫痫综合征与特发性癫痫，尤其是热性惊厥相关癫痫（epilepsyassociatedwithfebrialseizures,EFS+）主要的致病基因和重要的候选基因。SCN1A相关EFS+临床表型复杂，涵盖了如GEFS+（Geneticepilepsywithfebrileseizuresplus），FEFS+（Focalepilepsywithfebrileseizures），Dravet综合征（Dravetsyndrome,DS）等一系列严重程度不一的表型。内含子处于基因非编码区，功能复杂，所涉及的基因剪切机制目前尚未完全清楚。前期研究在EFS+表型FEFS+和DS中发现5个SCN1A内含子不同区域的突变，经Minigene体外剪切实验，明确这些突变均可造成mRNA剪切的异常，从而表现为SCN1A的截短突变，并有可能导致Nav1.1蛋白的截短。但其最终的Nav1.1蛋白表达情况及差异，以及其与表型的相关性尚不清楚。<br>　　目的：在前期SCN1A内含子突变的基因表达研究基础上，通过构建SCN1A截短突变重组质粒，经HEK-293T细胞体外表达，检测SCN1A内含子不同区域突变后相应截短蛋白表达情况及其差异，以探究其可能的致病机制及与EFS+临床表型轻重之间的相关性。<br>　　方法：纳入前期研究已证实的5个EFS+相关的SCN1A内含子不同区域的突变（固有剪切位点突变c.602+1G＞A、c.4853-1G＞C；可变剪切位点突变c.473+5G＞A，c.473+5G＞C；深部内含子突变c.4853-25T＞A）所致4个截短突变，以野生型质粒pCMV-EYFP-SCN1A-WT为模板，通过定点诱变，构建伴有融合表达EYFP的截短突变重组质粒（pCMV-EYFP-MuSCN1A）；通过细胞转染，将重组质粒于HEK293-T细胞体外表达后提取总蛋白（Input）与表面蛋白（Surface），应用western-bloting（WB）技术对Nav1.1蛋白在细胞的表达进行定性和定量分析；进一步通过激光共聚焦检测荧光技术，观察和分析Nav1.1蛋白的亚细胞分布情况并进行荧光定量分析。<br>　　结果：1、经测序验证,成功构建了4个SCN1A内含子突变相关截短突变质粒：c.602+1G＞A对应突变体pCMV-EYFP-602，c.4853-1G＞C对应突变体pCMV-EYFP-4853-1；c.473+5G＞A和c.473+5G＞C对应突变体pCMV-EYFP-473;c.4853-25T＞A对应突变体pCMV-EYFP-4853-25。<br>　　2、WB结果显示，与固有剪切位点并DS相关的SCN1A突变体所致的Nav1.1截短蛋白p.T160-V203del和p.G1618-I1625del可在细胞膜上表达（分子量分别为223.8KD和228.1KD），表达量较野生型明显增多（前者p＜0.001，后者p=0.008）；与可变剪切位点并FEFS+相关的SCN1A突变体所致的Nav1.1截短蛋白p.V126fsX135（预测分子量15.3KD）未见有细胞膜的表达，而另一与深部内含子区并FEFS+相关的SCN1A突变体所致的Nav1.1截短蛋白p.G1618VfsX1625（分子量185.5KD）在细胞膜表达的水平较野生型明显减少（p＜0.001）；不同表型之间，FEFS+相关突变体截短蛋白的细胞膜表达水平明显少于DS相关突变体（p＜0.001）。<br>　　3、激光共聚焦显微镜检测可见，Nav1.1野生型蛋白在胞浆中分布少且均匀；而Nav1.1截短蛋白大部分滞留在内质网区，内质网结构杂乱不清。p.T160-V203del和p.G1618-I1625del截短蛋白在细胞膜上显示的荧光比野生型明显增强，差异有统计学意义（前者P＜0.001，后者P=0.013）；p.V126fsX135和p.G1618VfsX1625截短蛋白在细胞膜上的荧光比野生型明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.001）；不同表型之间，FEFS+相关突变体的细胞膜荧光表达水平明显低于DS相关突变体（P＜0.001）。<br>　　结论：1、位于固有剪切位点、可变剪切位点和深部内含子区等SCN1A基因内含子不同区域的突变均可能导致Nav1.1蛋白发生异常截短；2、SCN1A基因内含子区不同区域突变所致截短蛋白在细胞膜上可有不同程度的表达，其表达差异与癫痫表型的严重程度存在相关性。