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Grx2在蓝光诱导视网膜光损伤中的保护作用及机制研究

摘要目的:<br>  1.建立蓝光诱导小鼠视网膜光损伤模型,检测Grx2在视网膜组织中的表达情况;<br>  2.探讨Grx2在蓝光诱导小鼠视网膜光损伤中的作用;<br>  3.建立蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞光损伤模型,探讨Grx2在蓝光诱导的ARPE-19细胞损伤中的作用及机制。<br>  方法:<br>  1.采用强度为2000Lux的蓝光设备对C57BL/6J小鼠进行蓝光光照,连续光照3天,每天5小时建立小鼠视网膜光损伤模型。采用ERG检测小鼠视网膜功能,HE染色观察小鼠视网膜组织结构损伤情况,real-timePCR和Westernblotting检测小鼠视网膜组织中Grx2的mRNA和蛋白表达水平。<br>  2.采用琼脂糖凝胶电泳鉴定Grx2基因敲除和敲入小鼠的基因型,Westernblotting检测转基因小鼠视网膜中Grx2蛋白表达情况。蓝光造模后,采用Westernblotting检测小鼠视网膜凋亡相关因子和JNK信号通路的蛋白水平。<br>  3.以1500Lux的蓝光对ARPE-19细胞光照0h、6h、12h、24h和48h等不同时间。采用CCK-8检测不同光照时间后ARPE-19的细胞活力,LDH释放实验检测细胞毒性,活性氧检测试剂盒检测细胞内总ROS,mitoSOX?检测线粒体ROS,使用real-timePCR检测ARPE-19细胞光照后Grx2mRNA表达水平,Westernblotting检测光照后Grx2和凋亡相关蛋白表达水平。<br>  4.慢病毒感染ARPE-19细胞,建立Grx2过表达和低表达模型,并分为CN组、CN+BL组、siGrx2+BL组、siNC+BL组、oeGrx2+BL组和oeNC+BL组,以24h为蓝光光照时间,对光照组进行蓝光光照。利用CCK-8检测蓝光诱导后ARPE-19的细胞活力,LDH释放实验检测细胞毒性,细胞凋亡检测法(Annexin-VFITC/PropidiumIodide)检测细胞凋亡率,mitoSOX?检测线粒体ROS,Mito-TrackerRed检测线粒体膜电位。将正常ARPE-19细胞和慢病毒感染细胞分为CN+BL组、siGrx2+BL组、siGrx2+SP+BL组、oeGrx2+BL组和oeGrx2+Ani+BL组,使用Westernblotting检测光照后凋亡相关蛋白表达水平和JNK信号通路的蛋白水平。<br>  结果:<br>  1.ERG结果显示C57BL/6J小鼠经2000Lux蓝光光照后暗适应的a波、b波以及明适应的b波振幅均明显降低,小鼠视网膜功能受损。HE结果显示视网膜外核层厚度明显变薄。小鼠视网膜组织中Grx2mRNA和蛋白水平显著升高。<br>  2.琼脂糖凝胶电泳成功鉴定Grx2基因敲除和基因敲入小鼠基因型。ERG结果显示Grx2KO小鼠光照后暗适应a波、b波及明适应的b波振幅显著降低,而Grx2KI小鼠光照后暗适应a波、b波及明适应的b波振幅未见明显降低。HE结果显示Grx2KO小鼠蓝光光照后视网膜外核层厚度明显变薄,Grx2KI小鼠光照后视网膜外核层厚度无显著改变。Westernblotting结果显示光照后Bax、CleavedCaspase3、CleavedCaspase9、Cytochromec和p-JNK蛋白水平显著增加,Bcl2蛋白显著降低。Grx2敲除后,相应蛋白的改变更加明显,而Grx2敲入后Bax、CleavedCaspase3、CleavedCaspase9、Cytochromec和p-JNK蛋白水平显著降低,Bcl2蛋白水平显著升高。<br>  3.蓝光光照ARPE-19细胞后,随着蓝光光照时间延长,ARPE-19细胞活力降低,细胞毒性和细胞凋亡显著增加。此外,蓝光可以刺激细胞内总ROS和MtROS显著增加,氧化应激加重,并呈一定时间依赖性。蓝光照射后Grx2mRNA和蛋白表达显著增加。Grx2mRNA表达在蓝光光照12h达高峰,而在蓝光光照24h的Grx2蛋白表达水平较12h时更高。光照后Bax、CleavedCaspase3和CleavedCaspase9蛋白表达呈时间依赖性增加,而Bcl-2呈时间依赖性降低。<br>  4.Grx2过表达能缓解蓝光诱导的ARPE-19细胞内的氧化应激反应,提高细胞活力,降低LDH释放量,减轻细胞毒性,提高线粒体膜电位,降低细胞凋亡率。此外,与CN+BL组相比,CN+SP+BL组p-JNK蛋白水平明显下降,而CN+Ani+BL组p-JNK蛋白水平显著增加。siGrx2+SP+BL组细胞p-JNK水平较siGrx2+BL组明显降低;oeGrx2+Ani+BL组细胞p-JNK水平较oeGrx2+BL组明显升高。另外,siGrx2+SP+BL组细胞Bax、CleavedCaspase3、CleavedCaspase9和Cytochromec蛋白水平较siGrx2+BL组明显降低,Bcl-2蛋白表达明显增高;而oeGrx2+Ani+BL组细胞Bax、CleavedCaspase3、CleavedCaspase9和Cytochromec蛋白水平较oeGrx2+BL组明显升高,Bcl-2蛋白表达明显下降。<br>  结论:<br>  1.蓝光光照后小鼠视网膜结构和功能明显受损,且可增加小鼠视网膜Grx2的表达。<br>  2.Grx2敲除会加重蓝光对小鼠视网膜结构和功能的损伤,激活JNK信号通路,促进细胞凋亡;而Grx2敲入会减轻蓝光对小鼠视网膜结构和功能的损伤,下调JNK信号通路,抑制细胞凋亡。<br>  3.蓝光可致ARPE-19细胞呈时间依赖性损伤。随着光照时间延长,细胞毒性加重,细胞活力降低,且细胞内总ROS和线粒体ROS增加,氧化应激加重,继而引起细胞凋亡。<br>  4.低表达Grx2显著降低蓝光诱导的ARPE-19细胞活力,加重细胞凋亡,而过表达Grx2可改善蓝光对ARPE-19细胞的损伤,增加细胞活力,抑制细胞凋亡。Grx2在蓝光诱导的ARPE-19细胞损伤中发挥一定保护作用,而这种保护作用可能是通过抑制JNK信号通路的活化实现。

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