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摘要流产是指妊娠不足28周，胎儿体重不足1000g而终止妊娠者。胚胎着床后31%发生自然流产。孕早期即妊娠12周之前发生的自然流产约占全部自然流产的80％以上，该疾病严重影响了孕龄期妇女的身心健康。母-胎界面免疫调节功能紊乱是导致孕早期自然流产的重要原因之一。母-胎界面主要由胎儿来源的滋养细胞，母体来源的蜕膜基质细胞（DSCs）和蜕膜免疫细胞（DICs）共同组成，共同参与母-胎界面免疫调节与妊娠的建立及维持。<br>　　巨噬细胞是早孕期蜕膜组织局部第二大类免疫细胞，约占DICs的10%-20%，是母-胎界面免疫耐受网络的核心成员之一。其根据表型和功能差异，巨噬细胞分为经典活化的促炎表型M1型和选择活化的抑炎表型M2型。母-胎界面蜕膜巨噬细胞（dMφ）表型调节失衡可导致免疫耐受网络受损，引发自然流产等不良妊娠结局的发生。<br>　　生长停滞特异性基因产物6（GAS6）是一种维生素K依赖性蛋白，其受体为酪氨酸激酶受体（TAM受体），包括TYRO3、AXL和MERTK。目前研究发现GAS6-TAM在免疫应答中发挥着重要作用，如调节凋亡细胞的吞噬，抑制炎症反应，以及调节NK细胞的分化等。然而母-胎界面中GAS6所扮演的角色尚无相关报道。本课题旨在探讨早孕期母-胎界面GAS6在免疫耐受调控中的作用及其异常表达在早期自然流产中的病理机制。以及更深层次的剖析母-胎免疫耐受机制，并为自然流产等母-胎免疫调节紊乱相关性疾病的临床防治提供理论依据。<br>　　第一部分 母-胎界面GAS6的定位及表达情况<br>　　目的：探究GAS6在分泌期子宫内膜和早孕期蜕膜组织中的定位，初步比较GAS6在子宫内膜基质细胞和蜕膜基质细胞中的表达差异。<br>　　方法：采用免疫组化检测分泌期子宫内膜组织（n=3）和人早孕期正常蜕膜组织(n=3)中GAS6表达，观察GAS6的定位及表达情况。<br>　　结果：（1）分泌期子宫内膜中腺体细胞和内膜间质细胞均表达GAS6，腺体细胞较间质细胞高表达GAS6。<br>　　（2）GAS6在蜕膜基质细胞中表达，蜕膜基质细胞较内膜间质细胞表达增加。<br>　　结论：蜕膜化过程中基质细胞内GAS6的表达显著增加。<br>　　第二部分 人蜕膜基质细胞和人蜕膜巨噬细胞的分离、提取、培养及鉴定<br>　　目的：建立DSCs和dMφ的分离、提取及培养方法，鉴定提取的DSCs及dMφ的纯度。<br>　　方法：收集10例早期自然流产和人工流产的蜕膜，通过胶原酶酶解法酶解组织，再依次过100目、300目、400目筛网过滤后得到混合细胞悬液，再用20%、40%、60%的Precoll梯度离心分离细胞悬液，得到DSCs和DICs。DSCs经Vimentin和CK7细胞免疫组化进行鉴定。CD14磁珠分选法从DICs中分离出dMφ，FITCanti-humanCD14、BV421anti-humanCD45流式染色后确定dMφ纯度。<br>　　结果：（1）梯度离心法能有效分离死细胞、DSCs、DICs、红细胞等其他细胞。DSCs中Vimentin呈阳性和CK7呈阴性，纯度高达100%。<br>　　（2）通过CD14磁珠分选法提取的dMφ纯度可高达93%以上。<br>　　结论：Ⅳ型胶原酶酶解组织后梯度离心能有效分离DSCs和DICs，磁珠分选法能有效提取dMφ。<br>　　第三部分 自然流产中GAS6及其受体的表达情况<br>　　目的：分析比较自然流产和正常妊娠早孕期蜕膜组织局部GAS6及其受体的表达差异<br>　　方法：收集人早孕期正常及自然流产的蜕膜组织，采用消化及密度梯度离心法分离、纯化正常人早孕期DSCs和dMφ。运用免疫组化、q-PCR及WesternBlot分析比较正常妊娠（n=10）及自然流产（n=10）中GAS6在蜕膜基质细胞的表达水平，运用q-PCR分析比较正常妊娠（n=10）及自然流产（n=10）中GAS6受体（TYRO3、AXL、MERTK）在dMφ的表达水平。<br>　　结果：（1）免疫组化、q-PCR及WesternBlot检测发现：与早孕期正常妊娠相比，自然流产患者蜕膜基质细胞中GAS6的表达显著降低。<br>　　（2）q-PCR结果显示:与早孕期正常妊娠相比，自然流产患者dMφ中GAS6受体MERTK的表达显著降低，而TYRO3、AXL未见统计学差异。<br>　　结论：母-胎界面GAS6/MERTK表达的异常降低可能参与了孕早期自然流产的发生。<br>　　第四部分 母-胎界面GAS6对dMφ分化的影响<br>　　目的：蜕膜局部特异性高表达的GAS6对dMφ分化的调节作用。<br>　　方法：收集人早孕期正常蜕膜组织，采用消化及密度梯度离心法分离、纯化正常人早孕期dMφ，采用不同浓度rhGas6（0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）处理原代蜕膜巨噬细胞48h，利用流式细胞术分析dMφ膜表面共刺激分子（CD80、CD86、CD206、CD209、CD163）及效应细胞因子（IL-12、IL-1β、IL-10、TGF-β1）的表达水平。<br>　　结果：100ng/mLrhGAS6处理dMφ，可显著促进其表面M2型共刺激分子CD163的表达（P＜0.05），200ng/mLrhGAS6处理dMφ，可显著促进其TGF-β1的分泌（P＜0.05）。而dMφ的其他膜表面共刺激分子（CD206、CD209、CD80、CD86）及效应细胞因子（IL-10、IL-12、IL-1β）均未见显著改变。<br>　　结论：母-胎界面GAS6可促进dMφ向M2型极化。