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酿酒酵母Elp3基因在Yap1氧化应激通路中的功能研究

摘要转录延伸复合物Elongator有六个亚基,Elp3是复合物发挥其主要功能的关键催化亚基。Elp3可乙酰化组蛋白和其他非组蛋白,但越来越多的研究表明Elp3也具有tRNA乙酰转移酶的功能。来自不同生物的研究表明,Elp3在应激反应、发育和神经元变性等多种生命活动中发挥作用。本实验室前期研究发现Elp3缺失的酵母菌株对过氧化氢高度敏感,并且在氧化胁迫下Elp3的缺失会影响转录因子Yap1的核累积。Yap1入核调控抗氧化基因的表达是氧化应激反应应答机制的关键,当细胞遭遇氧化胁迫,Yap1在Gpx3、Trx2、Ybp1的帮助下入核与转录因子Skn7一起调控抗氧化相关蛋白的表达。为了进一步研究Elp3在Yap1通路中的功能,我们进行了如下工作:(1)构建Gpx3、Trx2、Ybp1共缺失和过表达elp3△菌株,通过过氧化氢敏感性实验、ROS、MDA及Yap1核积累检测,探索Elp3在Gpx3、Trx2、Ybp1辅助Yap1入核中的功能;(2)将Yap1-GFP融合表达质粒转入各突变株,通过荧光显微镜观察检测Elp3与Yap1入核辅助蛋白共缺失对Yap1核积累的影响;(3)构建Elp3诱饵表达载体,通过酵母双杂检测其与Gpx3、Trx2、YBP、Yap1、Skn7等Yap1通路相关蛋白之间是否相互作用;(4)构建myc-Elp3融合表达载体,通过ChIP-PCR确定Elp3是否参与Yap1通路相关基因的转录延伸。<br>  上述实验结果表明:氧化胁迫条件下,Gpx3、Trx2、Ybp1共缺失可显著增加elp3△菌株的H2O2敏感性、使其ROS、MDA升高、Yap1的核累积量显著下降;Elp3正常表达情况下,三者过表达均可明显提高野生型的H2O2耐受性,使ROS、MDA显著降低,但同样的Gpx3、Trx2、Ybp1过表达质粒转入elp3△菌株却不能改善其过氧化氢敏感表型,其MDA、ROS水平也与elp3△菌株近似。表明Elp3为Gpx3、Trx2、Ybp1协助Yap1入核所必需。对Yap1、Yap1-Skn7转录活性检测,发现Trx2缺失不会降低Yap1的转录活性,但是可以降低Yap1-Skn7的转录活性,这可能与Trx2在Yap1通路中的双重调控功能相关;Gpx3、Ybp1缺失Yap1、Yap1-Skn7转录活性均显著降低;但是Elp3缺失Yap1、Yap1-Skn7转录活性却明显升高,我们推测Elp3缺失后胞内高水平ROS、MDA触发了氧化还原系统中其他未知通路从而激活Yap1,以对抗细胞内过量的过氧化物对细胞的损害。虽然双杂交实验未发现Elp3与Gpx3、Trx2、YBP、Yap1、Skn7之间存在直接的相互作用;但ChIP-PCR实验提供了Elp3通过促进Yap1通路相关基因转录延伸参与酿酒酵母氧化应激调控的重要证据。

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