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摘要目的:<br>　　三氯乙烯作为重要的生产性毒物，其中毒能诱发职业性药疹样皮炎。临床研究表明职业性三氯乙烯中毒常伴有多脏器损伤，其中以肝脏损伤尤为严重，但是目前其对肝脏的急性损伤机制尚未完全阐明。有研究提出，氧化应激是三氯乙烯引起肝脏损伤的重要机制。Nrf2信号通路是细胞抗氧化应激的中枢调节者，负责调控抗氧化蛋白的表达。然而，有关三氯乙烯对肝脏的氧化应激作用及对Nrf2信号通路的影响目前报道甚少。因此，本研究拟以HepG2细胞为研究对象，以不同剂量的三氯乙烯处理HepG2细胞，建立三氯乙烯染毒模型，探究三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激效应中Nrf2信号通路的作用。并进一步选择Nrf2激动剂tBHQ和抑制剂木犀草素（luteolin）,分别对Nrf2信号因子进行上调或下调，探究Nrf2信号通路在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激效应中的调控作用，深入揭示三氯乙烯的毒作用机制。<br>　　方法:<br>　　取人肝肿瘤细胞HepG2进行体外培养实验。具体操作如下：<br>　　取对数生长期的HepG2细胞进行后续实验，实验分组如下：对照组和低、中、高剂量TCE组：用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h；tBHQ对照组和tBHQ+低、中、高剂量TCE组：用含终浓度为50μmol/LtBHQ的完全培养基预处理12h后，用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h；luteolin对照组和luteolin+低、中、高剂量TCE组：用含终浓度为10μmol/Lluteolin的完全培养基预处理12h后，用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h。染毒结束后，收获细胞，采用2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐（WST-8）法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力，酶促法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、过氧化氢酶（CAT）活力，硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）水平，酶联免疫吸附（Elisa）法检测8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）水平，实时荧光聚合酶链式反应法（PCR）检测核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、醌氧化还原酶1（NQO1）的mRNA表达，蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1蛋白的表达。<br>　　结果:<br>　　（1）三氯乙烯对HepG2细胞氧化应激的影响：TCE染毒24h后，和对照组相比，低剂量组MDA水平下降（P＜0.05），高剂量组SOD活力升高（P＜0.05），低、中、高剂量组CAT活力均下降（均P＜0.05），但GSH-Px活力均升高（均P＜0.05）。在TCE中剂量（4mmol/L）的条件下，CAT活力明显低于低剂量组（P＜0.05），MDA水平明显高于低剂量组（P＜0.05）；和中剂量组相比，高剂量组SOD、CAT活力明显降低（均P＜0.05），MDA、8-OHDG水平稍有降低（均P＞0.05）。<br>　　（2）三氯乙烯对HepG2细胞Nrf2信号通路的影响：TCE染毒24h后，和对照组相比，低、中剂量组Nrf2、GCLCmRNA和蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.05），HO-1mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05），中剂量组HO-1蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.05），高剂量组Nrf2、HO-1mRNA和蛋白相对水平明显升高（P＜0.05），GCLCmRNA和蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.05），NQO1mRNA相对水平明显升高（P＜0.05），低、中、高剂量组NQO1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。高剂量组Nrf2、NQO1的mRNA和蛋白相对表达水平以及HO-lmRNA相对表达水平明显高于低、中剂量组（P＜0.05），HO-1、GCLC蛋白相对表达水平明显高于中剂量组（P＜0.05）。<br>　　（3）Nrf2信号因子上调后对三氯乙烯致HepG2氧化应激及Nrf2信号通路的影响：与对照组相比，tBHQ对照组SOD、GSH-Px活力明显升高（均P＜0.05），CAT活力明显降低（P＜0.05），MDA水平明显降低（P＜0.05），tBHQ+低、中、高剂量组GSH-Px活力明显升高（均P＜0.05），tBHQ+中、高剂量组CAT活力明显升高（均P＜0.05）；与tBHQ未预处理同剂量TCE单独染毒组相比，tBHQ+中剂量组SOD活力明显升高（P＜0.05），tBHQ+中、高剂量组GSH-Px、CAT活力均明显升高（均P＜0.05），MDA水平降低但变化不明显（P＞0.05）。与对照组相比，tBHQ对照组Nrf2、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），HO-1蛋白相对表达水平明显升高（P＜0.05），tBHQ+低、中、高剂量组GCLCmRNA相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），NQO1mRNA相对表达水平均明显降低（均P＜0.05），HO-1蛋白相对表达水平均明显降低（均P＜0.05），tBHQ+中、高剂量组Nrf2、HO-1mRNA相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），NQO-1mRNA相对表达水平明显降低，HO-1蛋白相对表达水平明显降低，tBHQ+高剂量组Nrf2、HO-1、GCLCmRNA相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1蛋白相对表达水平均明显升高（均P＜0.05）；与tBHQ未预处理同剂量TCE单染毒组相比，tBHQ+中剂量组Nrf2、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），HO-1蛋白相对表达水平明显升高（P＜0.05），tBHQ+高剂量组Nrf2、GCLCmRNA和蛋白相对表达水平均明显升高（均P＜0.05），HO-1蛋白相对表达水平明显升高（P＜0.05）。<br>　　（4）Nrf2信号因子下调后对三氯乙烯致HepG2氧化应激及Nrf2信号通路的影响：与对照组相比，luteolin+低、中、高剂量组CAT活力明显降低（均P＜0.05），luteolin+高剂量组SOD活力明显降低（P＜0.05）；与luteolin未预处理同剂量TCE单独染毒相比，luteolin+低、中、高剂量组CAT活力明显降低（P＜0.05），GSH-Px活力明显升高（均P＜0.05），luteolin+低、高剂量组MDA水平明显升高（P＜0.05），luteolin+中、高剂量组8-OHDG水平明显升高（P＜0.05），luteolin+高剂量组SOD活力明显降低（P＜0.05）。与对照组相比，luteolin对照组Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低（均P＜0.05）；与luteolin未预处理同剂量TCE单染毒组相比，luteolin+低剂量组Nrf2蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.05），HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低（均P＜0.05），luteolin+中剂量组Nrf2、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低（均P＜0.05），HO-1蛋白相对表达水平明显降低（P＜0.05），luteolin+高剂量组Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低（均P＜0.05）。<br>　　结论:<br>　　（1）一定剂量的三氯乙烯可致HepG2细胞发生氧化应激，降低细胞内抗氧化酶的活力，造成氧化损伤。<br>　　（2）一定剂量的三氯乙烯可激活HepG2细胞Nrf2信号通路，下游HO-1、GCLC、NQO1基因和蛋白的表达水平升高，提升抗氧化物酶活力，发挥Nrf2介导的抗氧化作用。<br>　　（3）在本研究条件下，Nrf2信号因子上调后，在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激过程中，对下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶的介导速度更快、正面调控作用增强，细胞抗氧化能力提升，从而拮抗三氯乙烯所致的氧化损伤。<br>　　（4）在本研究条件下，Nrf2信号因子下调后，下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶表达水平明显下降，在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激过程中基因和蛋白合成受阻，抗氧化机制失衡，HepG2细胞所受氧化损伤加重。