摘要目的:<br> 三氯乙烯作为重要的生产性毒物,其中毒能诱发职业性药疹样皮炎。临床研究表明职业性三氯乙烯中毒常伴有多脏器损伤,其中以肝脏损伤尤为严重,但是目前其对肝脏的急性损伤机制尚未完全阐明。有研究提出,氧化应激是三氯乙烯引起肝脏损伤的重要机制。Nrf2信号通路是细胞抗氧化应激的中枢调节者,负责调控抗氧化蛋白的表达。然而,有关三氯乙烯对肝脏的氧化应激作用及对Nrf2信号通路的影响目前报道甚少。因此,本研究拟以HepG2细胞为研究对象,以不同剂量的三氯乙烯处理HepG2细胞,建立三氯乙烯染毒模型,探究三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激效应中Nrf2信号通路的作用。并进一步选择Nrf2激动剂tBHQ和抑制剂木犀草素(luteolin),分别对Nrf2信号因子进行上调或下调,探究Nrf2信号通路在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激效应中的调控作用,深入揭示三氯乙烯的毒作用机制。<br> 方法:<br> 取人肝肿瘤细胞HepG2进行体外培养实验。具体操作如下:<br> 取对数生长期的HepG2细胞进行后续实验,实验分组如下:对照组和低、中、高剂量TCE组:用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h;tBHQ对照组和tBHQ+低、中、高剂量TCE组:用含终浓度为50μmol/LtBHQ的完全培养基预处理12h后,用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h;luteolin对照组和luteolin+低、中、高剂量TCE组:用含终浓度为10μmol/Lluteolin的完全培养基预处理12h后,用含终浓度为0、2、4、8mmol/L三氯乙烯的完全培养基染毒24h。染毒结束后,收获细胞,采用2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力,酶促法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、过氧化氢酶(CAT)活力,硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)水平,酶联免疫吸附(Elisa)法检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,实时荧光聚合酶链式反应法(PCR)检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1蛋白的表达。<br> 结果:<br> (1)三氯乙烯对HepG2细胞氧化应激的影响:TCE染毒24h后,和对照组相比,低剂量组MDA水平下降(P<0.05),高剂量组SOD活力升高(P<0.05),低、中、高剂量组CAT活力均下降(均P<0.05),但GSH-Px活力均升高(均P<0.05)。在TCE中剂量(4mmol/L)的条件下,CAT活力明显低于低剂量组(P<0.05),MDA水平明显高于低剂量组(P<0.05);和中剂量组相比,高剂量组SOD、CAT活力明显降低(均P<0.05),MDA、8-OHDG水平稍有降低(均P>0.05)。<br> (2)三氯乙烯对HepG2细胞Nrf2信号通路的影响:TCE染毒24h后,和对照组相比,低、中剂量组Nrf2、GCLCmRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05),HO-1mRNA相对表达水平明显降低(P<0.05),中剂量组HO-1蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05),高剂量组Nrf2、HO-1mRNA和蛋白相对水平明显升高(P<0.05),GCLCmRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05),NQO1mRNA相对水平明显升高(P<0.05),低、中、高剂量组NQO1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。高剂量组Nrf2、NQO1的mRNA和蛋白相对表达水平以及HO-lmRNA相对表达水平明显高于低、中剂量组(P<0.05),HO-1、GCLC蛋白相对表达水平明显高于中剂量组(P<0.05)。<br> (3)Nrf2信号因子上调后对三氯乙烯致HepG2氧化应激及Nrf2信号通路的影响:与对照组相比,tBHQ对照组SOD、GSH-Px活力明显升高(均P<0.05),CAT活力明显降低(P<0.05),MDA水平明显降低(P<0.05),tBHQ+低、中、高剂量组GSH-Px活力明显升高(均P<0.05),tBHQ+中、高剂量组CAT活力明显升高(均P<0.05);与tBHQ未预处理同剂量TCE单独染毒组相比,tBHQ+中剂量组SOD活力明显升高(P<0.05),tBHQ+中、高剂量组GSH-Px、CAT活力均明显升高(均P<0.05),MDA水平降低但变化不明显(P>0.05)。与对照组相比,tBHQ对照组Nrf2、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显升高(均P<0.05),HO-1蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05),tBHQ+低、中、高剂量组GCLCmRNA相对表达水平均明显升高(均P<0.05),NQO1mRNA相对表达水平均明显降低(均P<0.05),HO-1蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),tBHQ+中、高剂量组Nrf2、HO-1mRNA相对表达水平均明显升高(均P<0.05),NQO-1mRNA相对表达水平明显降低,HO-1蛋白相对表达水平明显降低,tBHQ+高剂量组Nrf2、HO-1、GCLCmRNA相对表达水平均明显升高(均P<0.05),Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1蛋白相对表达水平均明显升高(均P<0.05);与tBHQ未预处理同剂量TCE单染毒组相比,tBHQ+中剂量组Nrf2、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显升高(均P<0.05),HO-1蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05),tBHQ+高剂量组Nrf2、GCLCmRNA和蛋白相对表达水平均明显升高(均P<0.05),HO-1蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)。<br> (4)Nrf2信号因子下调后对三氯乙烯致HepG2氧化应激及Nrf2信号通路的影响:与对照组相比,luteolin+低、中、高剂量组CAT活力明显降低(均P<0.05),luteolin+高剂量组SOD活力明显降低(P<0.05);与luteolin未预处理同剂量TCE单独染毒相比,luteolin+低、中、高剂量组CAT活力明显降低(P<0.05),GSH-Px活力明显升高(均P<0.05),luteolin+低、高剂量组MDA水平明显升高(P<0.05),luteolin+中、高剂量组8-OHDG水平明显升高(P<0.05),luteolin+高剂量组SOD活力明显降低(P<0.05)。与对照组相比,luteolin对照组Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05);与luteolin未预处理同剂量TCE单染毒组相比,luteolin+低剂量组Nrf2蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05),HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),luteolin+中剂量组Nrf2、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),HO-1蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05),luteolin+高剂量组Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05)。<br> 结论:<br> (1)一定剂量的三氯乙烯可致HepG2细胞发生氧化应激,降低细胞内抗氧化酶的活力,造成氧化损伤。<br> (2)一定剂量的三氯乙烯可激活HepG2细胞Nrf2信号通路,下游HO-1、GCLC、NQO1基因和蛋白的表达水平升高,提升抗氧化物酶活力,发挥Nrf2介导的抗氧化作用。<br> (3)在本研究条件下,Nrf2信号因子上调后,在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激过程中,对下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶的介导速度更快、正面调控作用增强,细胞抗氧化能力提升,从而拮抗三氯乙烯所致的氧化损伤。<br> (4)在本研究条件下,Nrf2信号因子下调后,下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶表达水平明显下降,在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激过程中基因和蛋白合成受阻,抗氧化机制失衡,HepG2细胞所受氧化损伤加重。
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