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摘要背景：<br>　　巨噬细胞(macrophage,m?)属于单核吞噬系统，在清除病原体异物、介导炎症反应、组织再生修复等方面发挥着重要作用。根据所处的具体微环境不同，巨噬细胞呈现出显著异质性。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下巨噬细胞向M1型极化，称为经典激活型巨噬细胞，能分泌IL-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF-α)、ROS等炎症因子，参与Th1型细胞免疫。在白介素-4(interleukin-4,IL-4)刺激下，巨噬细胞向M2型极化，称为替代激活型巨噬细胞，表达甘露糖受体(CD206)、精氨酸酶-1(Arg-1)、IL-10等抗炎分子，参与组织修复。巨噬细胞本身具有高度可塑的特征，已极化的巨噬细胞可以在局部微环境调节下发生表型的转换。<br>　　骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种磷酸化的骨基质糖蛋白，广泛表达于各种免疫细胞如T细胞、巨噬细胞及树突状细胞等。作为潜在的免疫调节因子，OPN被认为是一种介导细胞免疫的Th1型促炎因子，可调节细胞粘附、迁移、生存，参与肉芽组织形成等。近年来的大量研究发现，OPN在抗炎机制中也有重要作用，可能兼具促炎和抗炎多重功能。<br>　　异物巨细胞(foreignbodygiantcells,FBGCs)是由多个巨噬细胞相互融合而成的多核巨细胞，其主要功能是吞噬隔离病原体和外来异物。以往认为FBGCs在种植体周围组织的长期存在是导致宿主异物排斥反应的主要原因，但越来越多的证据表明，FBGCs在生物材料引起机体异物反应中的确切作用还需要深入研究。有报道认为，FBGCs也有异质性，具备M1/M2等极化表型特征，FBGCs的存在对种植体-骨界面的骨结合可能具有不可或缺的作用。<br>　　目的：<br>　　第一部分：巨噬细胞极化实验<br>　　选取小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型，添加外源性OPN，并将OPN与极化诱导剂（LPS、IL-4）联合培养,qRT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫荧光检测相应极化基因标志物的表达情况，探索OPN对巨噬细胞极化的影响。第二部分：巨噬细胞融合实验<br>　　选取小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型，添加外源性OPN，并将OPN与融合诱导剂IL-4联合培养4-5天，MGG染色观察FBGCs形成，qRT-PCR、Westernblot检测融合基因表达情况，探索OPN对巨噬细胞融合形成FBGCs的影响。<br>　　方法：<br>　　第一部分：探索外源性OPN对巨噬细胞极化的影响<br>　　体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7，按照如下分组实验，对照组不加任何因子：①OPN浓度梯度实验：设定对照组，实验组加入不同浓度OPN(0.1，0.5，1μg/ml)。②M1型极化实验：设定对照组，LPS(100ng/ml)组，OPN(1μg/ml)组，LPS+OPN组。③M2型极化实验：设定对照组，IL-4(20ng/ml)组，OPN(1μg/ml)组，IL-4+OPN组。培养24h后，qRT-PCR检测M1型基因iNOS、TNF-α、IL-1β及M2型基因CD206、Arg-1、IL-10的mRNA表达；Westernblot检测iNOS、Arg-1的蛋白表达；ELISA检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度；免疫荧光检测iNOS、CD206的表达。<br>　　第二部分：探索外源性OPN对巨噬细胞融合形成FBGCs的影响<br>　　体外培养RAW264.7细胞，按以下分组实验：设定对照组，不同浓度OPN(0.1，0.5，1μg/ml)组，IL-4(20ng/ml)组，IL-4+OPN组。培养细胞4-5天后，MGG染色观察FBGCs形成。培养2天后，qRT-PCR检测融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2的mRNA表达；Westernblot检测ATP6V0D2的蛋白表达。<br>　　结果：<br>　　第一部分：巨噬细胞极化实验结果<br>　　1.qRT-PCR显示：与对照组比较，OPN组的M1型基因iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达显著上调(P＜0.05)，LPS+OPN组上调程度最高(P＜0.05)；OPN组的M2型基因CD206、Arg-1、IL-10的mRNA表达也显著上调(P＜0.05)，IL-4+OPN组上调程度最高(P＜0.05)。<br>　　2.Westernblot显示：与对照组比较，OPN组的iNOS、Arg-1蛋白表达均增强；LPS+OPN组的iNOS蛋白表达最强，IL-4+OPN组的Arg-1蛋白表达最强。<br>　　3.ELISA显示：OPN刺激细胞后，上清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度均显著升高(P＜0.05)；LPS+OPN组上清中炎症因子TNF-α、IL-1β浓度最高(P＜0.05)，IL-4+OPN组上清中抗炎因子IL-10浓度最高(P＜0.05)。<br>　　4.免疫荧光显示：与对照组比较，OPN组的iNOS、CD206表达均增强；LPS+OPN组的iNOS表达量最高，IL-4+OPN组的CD206表达量最高。<br>　　第二部分：巨噬细胞融合实验结果<br>　　在IL-4(20ng/ml)诱导下体外培养RAW264.7细胞4-5天，MGG染色可观察到多核的FBGCs形成。单独OPN刺激细胞后，也有部分FBGCs形成。IL-4+OPN联合培养组的FBGCs数量最多。qRT-PCR检测显示:与对照组比较，OPN组的融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2表达显著上调(P＜0.05)，IL-4+OPN组上调程度最高(P＜0.05)。Westernblot检测显示：OPN组的ATP6V0D2蛋白表达增强，IL-4+OPN组表达最强。<br>　　结论：<br>　　实验结果显示，在没有极化诱导剂(LPS、IL-4)时，OPN本身可促进M1型及M2型分子的表达，并在一定浓度范围内(0.1-1μg/ml)呈浓度依赖关系。进一步研究发现，OPN可与LPS和IL-4诱导剂呈协同促进作用。这提示OPN作为巨噬细胞的活化因子，可能激活静止的巨噬细胞，刺激其产生介于M1-M2型之间的混合表型，分泌一系列细胞因子。根据所处的微环境不同，OPN可能具有促炎和抗炎双向作用。<br>　　另外也发现，OPN本身可诱导巨噬细胞融合形成多核的FBGCs，并与IL-4有协同促进作用，相应融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2表达上调。