粗壮女贞提取物预防动脉粥样硬化的作用及机制研究-论文-万方医学网

粗壮女贞提取物预防动脉粥样硬化的作用及机制研究

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摘要研究背景与目的 　　动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）及其引起的心血管疾病已成为严重危害全球人类健康的重要公共卫生难题之一。因此，安全有效的预防AS策略对于降低心血管疾病的发病率和死亡率变得尤为重要。生活方式，尤其是膳食策略目前被认为是预防AS的有效途径。流行病学证据表明增加富含多酚、黄酮、膳食纤维等的食物摄入，如蔬菜、水果、茶等可降低成年人心血管疾病的发病风险。因此，探索天然植物及其提取物预防AS的作用已成为近年来的研究热点。 　　粗壮女贞水提物是一种安全、价廉、易接受且具有地方优势的植物，在我国西部地区具有悠久的饮用历史。本课题组前期研究结果显示，粗壮女贞水提物具有降脂、减重和保护血管内皮细胞等功能，提示粗壮女贞水提物可能具有预防AS的功效。但目前国内外对于粗壮女贞水提物能否预防AS、以及其可能的作用机制仍未见相关报道。 　　粗壮女贞水提物富含多种黄酮类、多糖类、酚类、生物碱类等化合物，而近年来研究表明富含黄酮类、多酚类等物质的天然提取物虽然生物利用度较低，但却有较长的肠道停留时间，可通过与肠道菌群的相关作用发挥健康效应。而肠道菌群及其代谢产物在AS的发生发展中具有重要作用。膳食胆碱或肉碱等物质经肠道菌群代谢产生的氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide，TMAO）能够通过干预机体胆固醇代谢和炎症反应等途径促进AS的发生与发展，是AS的独立危险因子。其他肠道菌群代谢物如胆汁酸（bileacids，BAs）和短链脂肪酸等（short-chainfattyacids，SCFAs）等也能通过干预机体胆固醇、炎症反应和内皮细胞功能障碍等途径影响AS的发生与发展。因此，调节肠道菌群及其代谢物已成为防治AS的新策略。另外，天然产物的入血成分可经血液循环被运送到相应的靶器官，发挥生物学效应。而本课题组前期动物实验和人群干预实验结果显示，粗壮女贞水提物具有通过调节肠道菌群从而预防和治疗肥胖的作用，并对血清TMAO具有一定的下调作用；但关于其入血成分及其作用机制尚不明确。因此，我们提出假设：粗壮女贞水提物一方面可以通过调节肠道菌群的结构和功能从而减少血清中TMAO水平和调节胆固醇代谢，进而预防AS；另一方面，粗壮女贞水提物中某些成分进入血液循环后，可能直接发挥预防AS的作用。为了验证上述假设，本研究将以高胆碱膳食小鼠C57BL/6J和Apoe-/-小鼠为研究对象，探究粗壮女贞水提物预防AS的效果，并从肠道菌群和入血成分两个方面探讨粗壮女贞水提物预防AS的潜在机制。 　　研究方法 　　第一部分 　　为初步评价粗壮女贞水提物调节高胆碱膳食肠道菌群、降低血清TMAO水平的可行性并筛选出合适的作用剂量。本研究将C57BL/6J小鼠随机分为正常膳食组、高胆碱膳食组和粗壮女贞水提物低、中、高剂量组，连续干预17周后，采集小鼠血清、盲肠内容物、肝脏、脾脏和肾脏。首先通过比较各组小鼠的体重、脏器系数、血清中肝、肾功能指标（AST、ALP、TP、ALT、ALB、GGT、Scr和BU）和病理变化，以评价粗壮女贞水提物对高胆碱膳食小鼠主要脏器的影响。利用实时荧光定量PCR分别测定各组小鼠盲肠内容物中与AS相关的硬壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属、阿克曼菌属和普雷沃氏菌属的细菌丰度；再利用LC-MS测定各组小鼠血清TMAO的水平。 　　在预实验的基础上，本研究选取载脂蛋白E缺失小鼠（Apoe-/-小鼠）作为研究对象，评价粗壮女贞水提物预防高胆碱膳食小鼠AS的效果。本研究将Apoe-/-小鼠随机分为正常膳食组、高胆碱膳食组、粗壮女贞水提物干预组和阳性药物对照组（广谱抗生素干预），连续干预17周后，采集小鼠血清、主动脉和主动脉瓣样本。利用油红O染色分别评价主动脉瓣和主动脉中动脉粥样硬化斑块的面积。通过免疫组化的方法分析各组小鼠动脉斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的含量。利用Luminex技术测定各组小鼠血清中ICAM-1、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ的水平，并利用免疫组化的方法测定各组小鼠主动脉瓣中ICAM-1和VCAM-1的含量。 　　第二部分 　　为分析肠道菌群在粗壮女贞水提物降低血清TMAO水平中的作用及其机制，本研究以高胆碱膳食C57BL/6J和Apoe-/-小鼠为研究对象，首先通过LC-MS测定高胆碱膳食Apoe-/-小鼠血清TMAO的水平。通过实时荧光定量PCR和Westernblot技术测定各组小鼠肝脏中FMO3的基因表达水平和蛋白表达水平；利用LC-MS技术体外评价各组小鼠肝脏FMO3的酶活性。为进一步验证粗壮女贞水提物是否是通过调节肠道菌群从而降低血清TMAO水平，本研究通过LC-MS技术评价各组小鼠盲肠内容物分解胆碱产生TMA的能力，并利用16SRNA测序技术，分析各组小鼠肠道菌群的变化；采用Spearman秩相关研究TMA和TMAO水平与肠道菌群之间的相互变化关系。 　　第三部分 　　为探究肠道菌群及其代谢物在粗壮女贞水提物调节胆固醇代谢中的作用，本研究以高胆碱膳食C57BL/6J和Apoe-/-小鼠为研究对象，采用ELISA测定各组小鼠肝脏、血清和粪便中胆固醇水平，并通过实时荧光定量PCR测定各组小鼠肝脏Hmgr、Sr-b1和回肠中Npc1L1和Abcg5/8的基因表达水平。利用LC-MS/MS技术测定各组小鼠肝脏、胆囊、小肠内容物、血清和粪便中主要胆汁酸的水平；利用实时荧光定量PCR和Westernblot分别测定各组小鼠肝脏中胆汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1和CYP7B1的基因表达水平和蛋白表达水平，并利用实时荧光定量PCR测定肝脏胆汁酸合成酶上游调节基因Fxr和Shp的基因表达水平。利用实时荧光定量PCR分析各组小鼠肝脏胆汁酸转运相关基因（Bsep、Mrp2、Mrp3和Mrp4）、回肠中胆汁酸转运相关基因（Asbt、Ostα和Ostβ）和肝脏中胆汁酸重吸收相关基因（Ntcp、Oatp1和Oatp2）的表达水平。并利用Spearman秩相关研究粪便各胆汁酸水平与肠道菌群之间的相互变化关系。最后，通过GC-MS测定各组小鼠粪便中短链脂肪酸的水平。 　　第四部分 　　为探究粗壮女贞水提物入血成分预防AS的效果及其机制，本研究通过比较灌胃粗壮女贞水提物的小鼠血清和空白小鼠血清，运用UPLC-Q-TOF-MS分析粗壮女贞水提物的入血成分，结合网络药理学分析，构建“成分-靶点-通路”网络，并结合GO、KEGG等数据库进行通路分析。根据网络药理学分析结果，利用TMAO建立体外的内皮细胞炎性损伤模型，通过Westernblot检测粗壮女贞水提物入血成分干预后ICAM-1和MCP-1蛋白表达水平以及JNK、p-JNK、Jun、p-Jun、c-Fos和p-c-Fos蛋白表达水平。利用JNK、Jun和c-Fos的抑制剂和激动剂分别处理细胞，通过Westernblot技术进一步明确JNK/AP-1信号通路在粗壮女贞水提物入血成分抑制内皮细胞炎症反应中的作用。 　　研究结果 　　第一部分 　　粗壮女贞水提物干预17周后，与高胆碱膳食C57BL/6J小鼠相比，低、中、高剂量粗壮女贞水提物干预组小鼠的体重较低（P＜0.05）。但各组小鼠间脏器指数和血清中肝肾功能指标间差异无统计学意义（P＞0.05）。脏器切片HE染色结果表明，与正常膳食小鼠相比，高胆碱膳食小鼠的肝脏和肾脏出现轻微损伤，而粗壮女贞水提物干预组小鼠肝脏和肾脏病未观察到明显的病理损伤。 　　各组C57BL/6J小鼠硬壁菌门、拟杆菌门和阿克曼菌属的细菌丰度间差异无统计学意义（P＞0.05）。与高胆碱膳食组小鼠相比，中、高剂量粗壮女贞水提物干预组小鼠放线菌门、乳酸杆菌属和双歧杆菌属细菌丰度增加（P＜0.05）；而中、高剂量粗壮女贞水提物干预后普雷沃氏菌属细菌丰度减少（P=0.006）。 　　与正常膳食组相比，高胆碱膳食组C57BL/6J小鼠血清TMA和TMAO水平均增高（P＜0.0001）；而中、高剂量粗壮女贞水提物干预后，血清TMA和TMAO水平明显降低（P＜.05），因此在后续实验中，本研究将选取中剂量粗壮女贞水提物进行干预，通过高胆碱膳食小鼠模型评价其预防AS的作用。 　　粗壮女贞水提物干预17周后，与正常膳食组Apoe-/-小鼠相比，高胆碱膳食组Apoe-/-小鼠主动脉瓣和主动脉中斑块比例明显增高（P＜0.05），提示造模成功。与高胆碱膳食组相比，粗壮女贞水提物干预组和广谱抗生素干预组小鼠主动脉和主动脉瓣中脂质斑块面积比例减小（P＜0.05）。提示粗壮女贞水提物可以预防高胆碱膳食诱导的AS。而免疫组化染色结果观察到粗壮女贞水提物干预组小鼠斑块中巨噬细胞含量降低（P=0.004）、平滑肌含量增高（P=0.005），提示粗壮女贞水提物可以提高AS斑块的稳定性。 　　血清Luminex结果表明粗壮女贞水提物干预后，高胆碱膳食Apoe-/-小鼠血清炎症因子ICAM-1、IL-1α、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平降低（P＜0.05）。同样，与高胆碱膳食组相比，粗壮女贞水提物干预组小鼠主动脉斑块中ICAM-1和VCAM-1含量降低（P＜0.05）。 　　第二部分 　　与正常膳食组Apoe-/-小鼠相比，高胆碱膳食组Apoe-/-小鼠血清TMA和TMAO水平增加（P＜0.0001）；而粗壮女贞水提物或广谱抗生素干预后小鼠血清TMA和TMAO水平降低（P＜0.05）。 　　在C57BL/6J和Apoe-/-小鼠模型中，RT-qPCR和Westernblot结果表明，与高胆碱膳食组小鼠相比，粗壮女贞水提物对肝脏FMO3的基因表达和蛋白表达水平无明显影响（P＞0.05）；体外评价FMO3活性的LC-MS结果也表明粗壮女贞水提物对肝脏FMO3蛋白活性无明显影响（P＞0.05）。但体外评价盲肠内容物代谢胆碱生成TMA能力的LC-MS结果表明，粗壮女贞水提物干预组小鼠盲肠内容物产生TMA的能力低于高胆碱膳食组小鼠（P＜0.001）。这提示粗壮女贞水提物降低高胆碱膳食小鼠TMAO水平，可能与调节肠道菌群相关，而与FMO3无关。 　　16SRNA测序结果表明各组小鼠肠道菌群α多样性差异无统计学意义（P＞0.05），但主成分分析观察到粗壮女贞水提物干预小鼠与高胆碱膳食组小鼠相比，肠道菌群结构发生改变。与正常膳食组小鼠相比，在门的水平上，粗壮女贞水提物干预的C57BL/6J和Apoe-/-小鼠的放线菌门细菌水平均提高（P＜0.05）；在属的水平上，粗壮女贞水提物干预的C57BL/6J小鼠Anaeroplasma（厌氧枝原体属）、Bacteroides（拟杆菌属）、Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Caldicoprobacter、Candidatus_Arthromitus（分节丝状菌属）、Candidatus_Saccharimonas、Desulfovibrio（脱硫弧菌属）、Eisenbergiella、Rikenellaceae_RC9_gut_group（理研菌科RC9群）和Ruminiclostridium_6（瘤胃梭菌属）的丰度增加；而Lachnospiraceae_NK4A136_group（毛螺菌科NK4A136群）、Prevotellaceae_UCG-001（普雷沃氏菌科UCG-001群）和uncultured_Bacteroidales_bacterium（不可培养拟杆菌属）的丰度降低（P＜0.05）。 　　在高胆碱膳食Apoe-/-小鼠中，粗壮女贞水提物干预后肠道菌群中Allobaculum（拟普雷沃菌属）、Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Clostridium_sensu_stricto_1（严格梭菌属）、Coriobacteriaceae_UCG-002（红蝽杆菌科UCG-002群）、Flavobacterium（黄杆菌属）、Parasutterella、Rikenellaceae_RC9_gut_group（理研菌科RC9群）、Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌属）和Staphylococcus（葡萄球菌属）的丰度增高，而Ambiguous_taxa、Butyricicoccus、Butyricimonas（丁酸弧菌属）、GCA-900066575、Helicobacter（螺杆菌属）、Intestinimonas、Lachnospiraceae_FCS020_group（毛螺菌科FCS020群）、Odoribacter、Oscillibacter（颤杆菌克属）、Ruminiclostridium（瘤胃梭菌属）和UBA1819的丰度降低（P＜0.05）。 　　进一步分析血清TMA和TMAO水平与肠道菌群属水平的关联性，结果表明血清TMA和TMAO可能与Oscillibacter（颤杆菌克属）、Alistipes（另枝菌属）、Prevotellaceae_UCG-001（普雷沃氏菌科UCG-001群）等菌属丰度呈正相关；可能与Candidatus_Arthromitus（分节丝状菌属）和Bacteroides（拟杆菌属）等菌属丰度呈负相关。 　　第三部分 　　与高胆碱膳食组C57BL/6J小鼠和Apoe-/-小鼠相比，粗壮女贞水提物干预组小鼠肝脏胆固醇水平降低，粪便胆固醇的水平增高（P＜0.05）；而与高胆碱膳食组Apoe-/-小鼠相比，粗壮女贞水提物干预Apoe-/-小鼠血清胆固醇水平降低（P＜0.05）。RT-qPCR结果表明，与高胆碱膳食组C57BL/6J小鼠和Apoe-/-小鼠相比，粗壮女贞水提物干预组小鼠肝脏Hmgr和回肠Abcg5基因表达水平无明显变化（P＞0.05），而肝脏Sr-1和回肠Abcg8基因表达水平明显增高（P＜0.05），同时回肠Npc1L1的基因表达水平降低（P＜0.05），提示粗壮女贞水提物可能通过增加胆固醇逆向转运、减少胆固醇吸收并提高胆固醇外排，从而影响胆固醇代谢。 　　连续灌胃17周后，与高胆碱膳食组小鼠相比，粗壮女贞水提物干预可降低小肠内容物中总胆汁酸水平（P＜0.05），增加粪便中总胆汁酸水平（P＜0.05），但对肝脏、胆囊和血清中总胆汁酸水平无明显影响（P＞0.05）。RT-qPCR和Westernblot的结果表明粗壮女贞水提物干预对肝脏CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1和CYP7B1的基因表达和蛋白表达水平均无明显作用（P＞0.05），对肝脏Fxr、Shp、Bsep、Mrp2、Mrp3、Mrp4和回肠中Fxr、Fgf15基因的表达也无明显影响（P＞0.05）；但粗壮女贞水提物干预能降低回肠中Ostα、Ostβ和肝脏中Ntcp的基因表达水平（P＜0.05）。提示粗壮女贞水提物可能降低肠道胆固醇转运和肝脏胆汁酸重吸收。 　　粗壮女贞水提物干预可提高胆碱膳食小鼠粪便中游离胆汁酸和总胆汁酸的水平，并调节粪便和血清中胆汁酸的结构，主要表现为粗壮女贞水提物干预的C57BL/6J小鼠粪便中ω-MCA和DCA水平增高（P＜0.05），血清中ω-MCA和DCA水平降低（P＜0.05）；粗壮女贞水提物干预的Apoe-/-小鼠粪便中CA和DCA的含量增高（P＜0.05），血清中CDCA和UDCA的含量降低（P＜0.05），而血清中TCA的水平增高（P=0.02）。进一步分析粪便各胆汁酸水平与肠道菌群属水平的关联性，结果表明游离型胆汁酸水平增高可能与产胆盐水解酶的Bifidobacterium（双歧杆菌属）等细菌丰度呈相关。另外，未观察到粗壮女贞水提物干预后粪便中短链脂肪酸（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸）水平存在差异（P＞0.05）。 　　第四部分 　　结合空白小鼠血清和粗壮女贞水提物的化学成分，从灌胃粗壮女贞水提物的小鼠血清中共鉴定出163个入血成分，包括72个原型成分和91个代谢产物。利用网络药理学方法构建了“粗壮女贞水提物入血成分-作用靶点-通路-AS”的综合网络，预测分析粗壮女贞水提物入血成分可能主要通过抗炎通路发挥预防AS作用。利用TMAO构建内皮细胞体外炎症模型，不同浓度的TMAO对内皮细胞增殖活力的影响结果显示0~4,000μMTMAO作用24h、48h和72h均不会对内皮细胞的增殖活力造成明显影响（P＞0.05）。当600μMTMAO作用内皮细胞24h后可引起细胞中ICAM-1和MCP-1蛋白表达量增高（P＜0.05），提示可采用600μMTMAO作用内皮细胞24h建立内皮细胞炎症损伤模型。Westernblot结果表明，正常对照组相比，TMAO模型组和空白血清干预组细胞ICAM-1表达增高，同时p-JNK/JNK、p-Jun/Jun和p-c-FOS/c-FOS比值增大，差异具有统计学意义（P＜0.05），而含粗壮女贞水提物入血成分血清预处理可以逆转这一现象。含粗壮女贞水提物入血成分血清+（JNK、Jun或c-FOS）抑制剂组与粗壮女贞水提物入血成分血清干预组的结果一致，而JNK、Jun或c-FOS的激动剂预处理后均可逆转这一结果。 　　研究结论 　　粗壮女贞水提物可通过改变肠道菌群的结构或功能减少血清TMAO的含量、增加胆汁酸排泄、减少胆汁酸重吸收，改善高胆碱膳食小鼠的胆固醇代谢紊乱；同时粗壮女贞水提物的入血成分可能通过JNK/AP-1通路抑制内皮细胞炎症性损伤，进而达到其预防AS的效果。 　　研究创新点 　　1.通过动物实验，本研究首次发现粗壮女贞水提物具有预防动脉粥样硬化的作用。 　　2.本研究发现粗壮女贞水提物预防动脉粥样硬化的作用可能与“肠道菌群-TMAO-胆固醇代谢”通路相关，未见相关报道。 　　3.本研究通过分析粗壮女贞水提物入血成分，利用网络药理学和血清药理学技术，通过细胞实验首次发现粗壮女贞水提物的入血成分可能通过JNK/AP-1通路抑制炎症反应，从而预防AS。 　　上述研究为地方特色植物粗壮女贞水提物的进一步开发利用以及预防动脉粥样硬化的天然物质的研发提供了参考依据。