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摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分：早期ARDS患者肺泡灌洗液和外周血血浆中细胞外囊泡的分离与鉴定<br>　　目的：<br>　　支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和外周血血浆中的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）与ARDS患者的肺损伤和预后相关。然而BALF和血浆中EVs分离和来源鉴定的方法目前尚无统一标准。本实验将分离提取EVs和鉴定EVs来源细胞的不同方法作对比，旨在为后续实验建立有效的分离和鉴定方法。<br>　　方法：<br>　　纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h，收集患者的 BALF和血浆。随后利用超速离心法（Ultracentrifugation）和尺寸排阻色谱柱方法（qEV）获得EVs。设置四种不同条件的超速离心方案：U1=超速离心100000g×2h、U2=120000g×2h、U3=120000g×70min和U4=187500×2h。通过下述三个方面比较U1、U2、U3、U4和Q（qEV）分离获得的EVs的差异。（1）纳米颗粒追踪分析仪（NTA）比较不同方法分离EVs粒径和浓度的差异。（2）使用透射电镜（TEM）和蛋白质印迹（WB）鉴定不同方法分离的 EVs形态及标志。（3）将纳米流式直接检测EVs表达CD31和CD68的结果作为鉴定内皮细胞和巨噬细胞来源的金标准，比较使用乳胶微球和链霉素生物素亲和微球捕获相同的 EVs后进行普通流式的检测结果与纳米流式结果。<br>　　结果：<br>　　1.比较不同分离方法获得EVs的粒径和浓度<br>　　四种不同超速离心获取的EVs沉淀由50uLPBS重悬后，NTA检测EVs粒径与浓度结果分别为U1=(190.8nm，2.5E+12/mL)、U2=(143.68nm，1.2E+12/mL)、U3=(139.4nm，8.2E+10/mL)和U4=（121.6nm，1.0E+13/mL）；qEV法通过色谱柱收集EVs，NTA检测结果为Q=（146.7nm，3.2E+7/mL）。<br>　　2.通过TEM和WB鉴定不同分离方法获得EVs<br>　　四种不同超速离心方法获得EVs的TEM结果相似，镜下描述为“杯子形状”囊泡状结构，粒径大小与NTA结果相仿。U1、U2、U3和U4比较，U2分离的EVs大小和分布更均一、背景更清晰；Q分离的EVs背景较U2杂乱。WB检测不同分离方法获取的EVs表面标志性蛋白分子CD9、CD63和CD81，其分子量均与参考范围相近。<br>　　3.比较不同流式方法检测EVs来源细胞的比例<br>　　纳米流式检测ARDS患者血浆中EVs表征结果显示表达CD31内皮细胞源性EVs约占20%，表达CD68巨噬细胞源性EVs约占9.4%。相同样本由乳胶微球和链霉素生物素亲和微球结合EVs后，通过普通流式检测CD31和CD68的表达比例。结果发现乳胶微球法检测CD31比例（21%）与链霉素生物素亲和法相比无明显差异（19.5%），并与纳米流式检测结果相似；乳胶微球法检测CD68比例（9%）高于链霉素生物素亲和微球法（5.8%）。<br>　　结论：<br>　　TEM、NTA和WB等鉴定结果显示，超速离心120000g×2h分离患者BALF和血浆中的EVs效果最佳；普通流式检测乳胶微球捕获EVs优于链霉素生物素微球。<br>　　第二部分：早期ARDS患者BALF和血浆中总EVs的特征<br>　　目的：<br>　　比较早期ARDS患者与非ARDS患者BALF和血浆中EVs的浓度和来源细胞差异，以及ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与ARDS病因和肺损伤严重程度的相关性。明确EVs能否作为ARDS潜在的生物标志物或治疗调节靶点。<br>　　方法：<br>　　纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者作为实验组，另纳入接受有创机械通气治疗的非ARDS患者作为对照组。收集入组患者的人口信息学，患者来源、基础疾病、病情严重程度、感染部位、实验室检查结果、器官功能支持等电子病历信息，在入组后的第24h和第72h，收集两组患者的BALF和血浆并记录样本体积。利用超速离心法120000g×2h分离EVs，NTA检测EVs浓度， EVs浓度表示为校正浓度，即EVs校正浓度=NTA测量的EVs浓度/样本体积。乳胶微球捕获法鉴定EVs来源细胞。<br>　　结果：<br>　　共有33例ARDS患者和10例非ARDS患者纳入研究。<br>　　1. ARDS组和非ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度比较<br>　　1.1 ARDS组和非ARDS组基础情况<br>　　1.2 ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度明显高于非ARDS组<br>　　2. ARDS组与非ARDS组BALF和血浆中EVs的来源细胞分布<br>　　ARDS患者的BALF中EVs来源细胞最多为上皮细胞（23.0%），其次为内皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞（21.8%、8.5%、3.9%和1.0%）；血浆中EVs来源细胞比例最高为内皮细胞（19.35%），其次为上皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(14.8%、6.1%、1.5%和0.7%)。<br>　　3. ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与肺损伤严重程度的相关性<br>　　根据柏林标准将ARDS患者分为轻中重三组。轻度ARDS组与中度ARDS组相比BALF中的EVs浓度无明显统计学差异（P=0.09），轻度ARDS组比重度ARDS组BALF中的EVs浓度明显降低（P=0.02）；不同程度ARDS患者血浆中EVs浓度之间无明显统计学差异。根据 P/F≥150将 ARDS患者分为轻度和中重度两组，中重度 ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于轻度ARDS（P=0.01），两组血浆中EVs浓度无统计学差异。<br>　　4.不同原因导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度的比较<br>　　4.1肺内病因导致的ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于肺外病因<br>　　4.2细菌性感染导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高<br>　　结论：<br>　　ARDS患者较非ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度增高。不同细胞来源的EVs在两组间存在差异。ARDS患者BALF来源的EVs浓度随ARDS肺损伤严重程度的增加呈现出升高趋势。细菌性感染所致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高。<br>　　第三部分：早期ARDS患者T细胞源性EVs与肺损伤严重程度和预后的相关性<br>　　目的：<br>　　T细胞在ARDS早期的发展中具有重要作用，但目前尚无证据证明ARDS肺损伤与T细胞分泌的EVs相关。本实验旨在探讨ARDS患者肺损伤严重程度以及预后与T细胞源性EVs的潜在相关性。<br>　　方法：<br>　　根据柏林诊断标准纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h，收集患者的BALF和血浆。利用超速离心法120000g×2h分离EVs，NTA检测EVs浓度，乳胶微球捕获法捕获EVs后进行流式细胞仪检测CD4和CD8信号鉴定细胞来源。评估肺损伤严重程度主要指标为氧合指数（P/F），次要指标为肺损伤评分（Murray评分）、肺驱动压（DP）和肺静态顺应性（Cst），主要结局指标为28天病死率，次要结局指标为ICU机械通气时间和90天病死率。<br>　　结果：<br>　　共有33例ARDS患者纳入研究。<br>　　1. ARDS组BALF和血浆中T细胞源性EVs明显高于非ARDS组<br>　　ARDS组患者BALF和血浆中的CD4+T细胞源性EVs（CD4+T-EVs）高于CD8+T细胞源性EVs（CD8+T-EVs）。ARDS组患者BALF与血浆中的CD4+T-EVs比例和CD8+T-EVs比例高于非ARDS组，但两组无显著的统计学差异。ARDS组BALF中两者的比例比（CD4/CD8+T-EVs）明显高于非ARDS组（P=0.016），而ARDS组血浆中两者的比例比（CD4/CD8+T-EVs）也明显高于非ARDS组（P=0.007）。<br>　　2. T细胞源性EVs与ARDS患者肺损伤严重程度无明显相关<br>　　ARDS患者BALF中CD4+T-EVs与P/F无明显统计学相关性（r=-0.09，P=0.61）；CD8+T-EVs与P/F也无关（r=0.19，P=0.30）。CD4/CD8+T-EVs与P/F无显著的统计学相关性（r=-0.27，P=0.13）。ARDS患者BALF中的CD4/8+T-EVs与机械通气时间也无明显相关性（P=0.31）。<br>　　3. T细胞源性EVs对ARDS患者预后有较好的预测价值<br>　　ROC曲线评估APACHEⅡ评分、SOFA评分以及CD4/8+T-EVs对28天预后和90天预后的预测价值，三者相比CD4/8+T-EVs的ROC曲线下面积最高，28天预后AUC为0.855，cut-off值为3.1。90天预后AUC为0.86，cut-off值为2.2。<br>　　结论：<br>　　早期ARDS患者BALF和血浆中T-EVs浓度高于非ARDS患者。ARDS患者BALF中CD4/CD8+T-EVs与ARDS患者肺损伤严重程度成正相关，并对ARDS患者的预后有较好的预测价值。