摘要本文主要从以下几个部分展开论述:<br> 第一部分:早期ARDS患者肺泡灌洗液和外周血血浆中细胞外囊泡的分离与鉴定<br> 目的:<br> 支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和外周血血浆中的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)与ARDS患者的肺损伤和预后相关。然而BALF和血浆中EVs分离和来源鉴定的方法目前尚无统一标准。本实验将分离提取EVs和鉴定EVs来源细胞的不同方法作对比,旨在为后续实验建立有效的分离和鉴定方法。<br> 方法:<br> 纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h,收集患者的 BALF和血浆。随后利用超速离心法(Ultracentrifugation)和尺寸排阻色谱柱方法(qEV)获得EVs。设置四种不同条件的超速离心方案:U1=超速离心100000g×2h、U2=120000g×2h、U3=120000g×70min和U4=187500×2h。通过下述三个方面比较U1、U2、U3、U4和Q(qEV)分离获得的EVs的差异。(1)纳米颗粒追踪分析仪(NTA)比较不同方法分离EVs粒径和浓度的差异。(2)使用透射电镜(TEM)和蛋白质印迹(WB)鉴定不同方法分离的 EVs形态及标志。(3)将纳米流式直接检测EVs表达CD31和CD68的结果作为鉴定内皮细胞和巨噬细胞来源的金标准,比较使用乳胶微球和链霉素生物素亲和微球捕获相同的 EVs后进行普通流式的检测结果与纳米流式结果。<br> 结果:<br> 1.比较不同分离方法获得EVs的粒径和浓度<br> 四种不同超速离心获取的EVs沉淀由50uLPBS重悬后,NTA检测EVs粒径与浓度结果分别为U1=(190.8nm,2.5E+12/mL)、U2=(143.68nm,1.2E+12/mL)、U3=(139.4nm,8.2E+10/mL)和U4=(121.6nm,1.0E+13/mL);qEV法通过色谱柱收集EVs,NTA检测结果为Q=(146.7nm,3.2E+7/mL)。<br> 2.通过TEM和WB鉴定不同分离方法获得EVs<br> 四种不同超速离心方法获得EVs的TEM结果相似,镜下描述为“杯子形状”囊泡状结构,粒径大小与NTA结果相仿。U1、U2、U3和U4比较,U2分离的EVs大小和分布更均一、背景更清晰;Q分离的EVs背景较U2杂乱。WB检测不同分离方法获取的EVs表面标志性蛋白分子CD9、CD63和CD81,其分子量均与参考范围相近。<br> 3.比较不同流式方法检测EVs来源细胞的比例<br> 纳米流式检测ARDS患者血浆中EVs表征结果显示表达CD31内皮细胞源性EVs约占20%,表达CD68巨噬细胞源性EVs约占9.4%。相同样本由乳胶微球和链霉素生物素亲和微球结合EVs后,通过普通流式检测CD31和CD68的表达比例。结果发现乳胶微球法检测CD31比例(21%)与链霉素生物素亲和法相比无明显差异(19.5%),并与纳米流式检测结果相似;乳胶微球法检测CD68比例(9%)高于链霉素生物素亲和微球法(5.8%)。<br> 结论:<br> TEM、NTA和WB等鉴定结果显示,超速离心120000g×2h分离患者BALF和血浆中的EVs效果最佳;普通流式检测乳胶微球捕获EVs优于链霉素生物素微球。<br> 第二部分:早期ARDS患者BALF和血浆中总EVs的特征<br> 目的:<br> 比较早期ARDS患者与非ARDS患者BALF和血浆中EVs的浓度和来源细胞差异,以及ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与ARDS病因和肺损伤严重程度的相关性。明确EVs能否作为ARDS潜在的生物标志物或治疗调节靶点。<br> 方法:<br> 纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者作为实验组,另纳入接受有创机械通气治疗的非ARDS患者作为对照组。收集入组患者的人口信息学,患者来源、基础疾病、病情严重程度、感染部位、实验室检查结果、器官功能支持等电子病历信息,在入组后的第24h和第72h,收集两组患者的BALF和血浆并记录样本体积。利用超速离心法120000g×2h分离EVs,NTA检测EVs浓度, EVs浓度表示为校正浓度,即EVs校正浓度=NTA测量的EVs浓度/样本体积。乳胶微球捕获法鉴定EVs来源细胞。<br> 结果:<br> 共有33例ARDS患者和10例非ARDS患者纳入研究。<br> 1. ARDS组和非ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度比较<br> 1.1 ARDS组和非ARDS组基础情况<br> 1.2 ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度明显高于非ARDS组<br> 2. ARDS组与非ARDS组BALF和血浆中EVs的来源细胞分布<br> ARDS患者的BALF中EVs来源细胞最多为上皮细胞(23.0%),其次为内皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(21.8%、8.5%、3.9%和1.0%);血浆中EVs来源细胞比例最高为内皮细胞(19.35%),其次为上皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(14.8%、6.1%、1.5%和0.7%)。<br> 3. ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与肺损伤严重程度的相关性<br> 根据柏林标准将ARDS患者分为轻中重三组。轻度ARDS组与中度ARDS组相比BALF中的EVs浓度无明显统计学差异(P=0.09),轻度ARDS组比重度ARDS组BALF中的EVs浓度明显降低(P=0.02);不同程度ARDS患者血浆中EVs浓度之间无明显统计学差异。根据 P/F≥150将 ARDS患者分为轻度和中重度两组,中重度 ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于轻度ARDS(P=0.01),两组血浆中EVs浓度无统计学差异。<br> 4.不同原因导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度的比较<br> 4.1肺内病因导致的ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于肺外病因<br> 4.2细菌性感染导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高<br> 结论:<br> ARDS患者较非ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度增高。不同细胞来源的EVs在两组间存在差异。ARDS患者BALF来源的EVs浓度随ARDS肺损伤严重程度的增加呈现出升高趋势。细菌性感染所致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高。<br> 第三部分:早期ARDS患者T细胞源性EVs与肺损伤严重程度和预后的相关性<br> 目的:<br> T细胞在ARDS早期的发展中具有重要作用,但目前尚无证据证明ARDS肺损伤与T细胞分泌的EVs相关。本实验旨在探讨ARDS患者肺损伤严重程度以及预后与T细胞源性EVs的潜在相关性。<br> 方法:<br> 根据柏林诊断标准纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h,收集患者的BALF和血浆。利用超速离心法120000g×2h分离EVs,NTA检测EVs浓度,乳胶微球捕获法捕获EVs后进行流式细胞仪检测CD4和CD8信号鉴定细胞来源。评估肺损伤严重程度主要指标为氧合指数(P/F),次要指标为肺损伤评分(Murray评分)、肺驱动压(DP)和肺静态顺应性(Cst),主要结局指标为28天病死率,次要结局指标为ICU机械通气时间和90天病死率。<br> 结果:<br> 共有33例ARDS患者纳入研究。<br> 1. ARDS组BALF和血浆中T细胞源性EVs明显高于非ARDS组<br> ARDS组患者BALF和血浆中的CD4+T细胞源性EVs(CD4+T-EVs)高于CD8+T细胞源性EVs(CD8+T-EVs)。ARDS组患者BALF与血浆中的CD4+T-EVs比例和CD8+T-EVs比例高于非ARDS组,但两组无显著的统计学差异。ARDS组BALF中两者的比例比(CD4/CD8+T-EVs)明显高于非ARDS组(P=0.016),而ARDS组血浆中两者的比例比(CD4/CD8+T-EVs)也明显高于非ARDS组(P=0.007)。<br> 2. T细胞源性EVs与ARDS患者肺损伤严重程度无明显相关<br> ARDS患者BALF中CD4+T-EVs与P/F无明显统计学相关性(r=-0.09,P=0.61);CD8+T-EVs与P/F也无关(r=0.19,P=0.30)。CD4/CD8+T-EVs与P/F无显著的统计学相关性(r=-0.27,P=0.13)。ARDS患者BALF中的CD4/8+T-EVs与机械通气时间也无明显相关性(P=0.31)。<br> 3. T细胞源性EVs对ARDS患者预后有较好的预测价值<br> ROC曲线评估APACHEⅡ评分、SOFA评分以及CD4/8+T-EVs对28天预后和90天预后的预测价值,三者相比CD4/8+T-EVs的ROC曲线下面积最高,28天预后AUC为0.855,cut-off值为3.1。90天预后AUC为0.86,cut-off值为2.2。<br> 结论:<br> 早期ARDS患者BALF和血浆中T-EVs浓度高于非ARDS患者。ARDS患者BALF中CD4/CD8+T-EVs与ARDS患者肺损伤严重程度成正相关,并对ARDS患者的预后有较好的预测价值。
更多相关知识
- 浏览0
- 被引0
- 下载0
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文