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摘要研究目的：<br>　　目前已有多项研究证实鸡血藤的单方或复方制剂对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用或辅助化疗药物增强效果。因此本实验拟研究鸡血藤膏含药血清、主要活性物质成分甘草素、异甘草素及其化学合成衍生物对结直肠癌细胞增殖的影响，以及ILQG-2d在体内外对HCT116细胞增殖的影响，并通过流式细胞技术、Western Blot、Real Time PCR、Transwell迁移和侵袭实验、质粒转染等实验方法进一步讨论其作用机制，以期为鸡血藤膏治疗结直肠癌提供更多的理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　体外实验：<br>　　1.通过CCK8法检测不同浓度鸡血藤膏含药血清对HCT116、SW480、HT29、DLD-1细胞的增殖抑制作用；通过倒置相差显微镜下观察鸡血藤膏含药血清对HCT116细胞形态变化的影响；采用流式细胞检测技术观察鸡血藤膏含药血清对HCT116细胞凋亡和周期的影响；Western Blot（WB）实验观察鸡血藤膏含药血清对HCT116细胞凋亡相关蛋白的影响。<br>　　2.通过MTT法检测不同浓度的甘草素、异甘草素对HCT116、HT29、DLD-1、SW480细胞的增殖抑制作用；筛选HCT116作为敏感细胞，通过MTT法检测异甘草素化学合成衍生物对HCT116的增殖抑制作用；筛选出ILQG-2d作为对HCT116细胞增殖抑制作用最强的药物，并用于后续机制研究。<br>　　3.倒置相差显微镜观察ILQG-2d对HCT116细胞形态变化的影响；流式细胞技术观察ILQG-2d对HCT116细胞凋亡和周期的影响；采用划痕实验检测ILQG-2d对HCT116细胞迁移的影响；采用transwell实验检测ILQG-2d对HCT116细胞迁移和侵袭的影响；采用Western Blot实验检测ILQG-2d对HCT116迁移、凋亡、周期及PI3K/AKT信号通路等相关蛋白表达的影响；Real Time-PCR（RT-PCR）检测ILQG-2d对HCT116细胞凋亡相关基因表达的影响。应用p53抑制剂PFT-α和shRNA p53阻断p53信号通路，观察ILQG-2d对沉默或抑制p53蛋白表达的HCT116细胞凋亡的影响。<br>　　体内实验：<br>　　采用人结肠癌HCT116细胞建立荷瘤鼠模型，分为阳性药物组（5-Fu组）腹腔注射给药，模型组、溶剂组、ILQG-2d高、中、低剂量组灌胃给药，观察ILQG-2d对裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响；采用HE染色法观察ILQG-2d对裸鼠脏器和移植瘤组织形态学变化的影响；TUNEL染色法观察ILQG-2d对裸鼠移植瘤组织细胞凋亡的影响；Western Blot实验、免疫组化实验分别检测凋亡相关蛋白表达情况。<br>　　研究结果：<br>　　体外实验：<br>　　1.CCK8实验结果显示：鸡血藤膏含药血清中高剂量组的5%、10%、20%对HCT116细胞的抑制作用最明显；Annexin-V FITC/PI双染实验结果显示：鸡血藤膏含药血清可诱导HCT116细胞凋亡，且随着浓度增大，凋亡率逐渐增加，呈现良好的量－效关系；经流式细胞仪周期分析结果显示：鸡血藤膏含药血清可阻滞细胞周期在G2/M期；Western Blot实验结果显示：鸡血藤膏含药血清组促凋亡蛋白Bax表达较对照组增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达较对照组减少。<br>　　2.MTT结果显示：甘草素和异甘草素对HCT116细胞抑制作用最强，表现为良好的浓度、时间依赖性，但IC50值偏高；异甘草素化学合成衍生物中ILQG-2d对HCT116的IC50值最低，其24h和48h IC50值分别为9.429μM和2.567μM。<br>　　3.倒置相差显微镜观察随着ILQG-2d浓度的增大，HCT116细胞形态逐渐改变，细胞间隙增大，排列较紊乱，形态固缩变圆，且部分细胞基本失去原有形态，呈漂浮状。划痕和transwell实验结果显示：与对照组相比，ILQG-2d(0.125,0.25,0.5μM）组的迁移率、迁移数量和侵袭数量差异有统计学意义（P＜0.05），提示ILQG-2d可显著抑制HCT116细胞的迁移和侵袭能力。Annexin-V FITC/PI双染实验结果显示：ILQG-2d（6.25、12.5、25μM）作用于HCT116细胞24h，与对照组相比，ILQG-2d可诱导HCT116细胞凋亡，且随着ILQG-2d剂量的增大，凋亡率逐渐增加，呈现良好的量－效关系。流式细胞仪周期分析结果显示：ILQG-2d对HCT116细胞周期的影响表现在阻滞细胞周期G2/M期。Western Blot（WB）实验结果显示：ILQG-2d能升高E-Cadherin、p53、p21、Cleaved-PARP、Bax、BAK、Caspase-9、Cleaved-caspase-9、caspase-3表达，降低MMP-3、MMP-9、Bcl-2、Cyclin-D1、Cyclin-B1、p-PI3K、p-AKT表达。Real Time-PCR（RT-PCR）结果显示：ILQG-2d上调促凋亡Bax mRNA表达水平，下调Bcl-2mRNA表达。应用p53抑制剂PFT-α和shRNA p53阻断p53信号通路，观察到ILQG-2d对HCT116细胞增殖抑制作用和诱导凋亡的作用被减弱。<br>　　体内实验：<br>　　体内实验结果显示，与模型组比较，5-Fu组和ILQG-2d给药组裸鼠瘤体积和瘤重量都显著减小，差异有统计学意义，说明阳性药物组和<br>　　ILQG-2d高、中、低剂量组能抑制裸鼠皮下移植瘤生长。裸鼠肿瘤组织HE和TUNEL染色显示：ILQG-2d可以抑制裸鼠肿瘤细胞生长和增加肿瘤组织中凋亡比率。肿瘤组织免疫组化（IHC）染色结果显示：与模型组比较，ILQG-2d高、中剂量组和5-Fu组p53、PTEN、Bax表达明显升高。裸鼠肿瘤组织Western Blot实验结果显示：ILQG-2d各给药组和5-fu阳性药物组Caspase3、Bax、p53、p21表达均较模型组升高，进一步验证了药物在体内的诱导肿瘤凋亡的作用。<br>　　研究结论：<br>　　鸡血藤膏和有效物质成分甘草素、异甘草素能够抑制结直肠癌细胞的增殖，且呈浓度－时间依赖性，其抗肿瘤机制可能与诱导结肠癌细胞凋亡和阻滞细胞周期G2/M期有关。其中异甘草素合成衍生物ILQG-2d在体内和体外对HCT116细胞的增殖具有显著的抑制作用，ILQG-2d能够诱导肿瘤细胞凋亡，阻滞细胞周期G2/M期，抑制肿瘤细胞转移，其作用机制可能是通过调节PI3K/AKT通路和激活p53通路实现的。