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摘要肾纤维化是慢性肾脏病（CKD）的常见病理特征，它影响着全球10%以上的人口，是一个重大的公共卫生难题。目前，TGF-β是已知最关键的致纤维化因子，并且与纤维化过程中代谢物的变化有着紧密的联系。而在TGF-β/Smads信号通路中，Smad泛素连接酶Smurfs对TGF-β/Smads信号通路的调控至关重要。综合前期的研究成果，发现肾康注射液可通过对TGF-β/Smads信号通路的调节而达到抗肾纤维化的作用，但其在该通路的抗肾纤维化作用靶点及分子药理学机制不十分清楚。结合相关文献报道与我们的前期研究基础，我们提出“肾康注射液可能通过促进Smurfs诱导TGF-β/Smads信号通路中TGF-β受体TβRⅠ/Ⅱ、p-Smad2/3的降解而发挥抗肾纤维化的作用”的假说。因此，本实验旨在探究肾康注射液是否可通过促进Smurfs诱导TGF-β/Smads信号通路的泛素化降解而达到抗肾纤维化的作用。<br>　　目的：<br>　　1、采用代谢组学技术手段对肾康注射液干预的输尿管结扎动物模型代谢物进行分析，筛选出与肾纤维化相关的差异代谢物，并将其代谢通路与TGF-β/Smads信号通路的相关性进行联合分析，有助于从代谢层面与分子水平阐释肾康注射液对肾纤维化的抑制机理。<br>　　2、采用细胞转染、免疫共沉淀、亚细胞共定位等技术手段，通过在体动物实验与体外细胞实验，明确肾康注射液可促进Smurfs诱导TGF-β/Smads信号通路中TGF-β受体TβRⅠ/Ⅱ、p-Smad2/3的降解而发挥抗肾纤维化的作用。<br>　　方法：<br>　　1、选取6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠作为研究对象，通过左侧输尿管结扎手术构造肾间质纤维化的输尿管梗阻性（UUO）模型，使用肾康注射液作为治疗药物，干预14天后，进行麻醉后取材。利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测肌酐（Creatinine,Cre）、尿素氮（BloodUreaNitrogen,BUN）的含量；HE法观察各组小鼠肾脏的病理情况；Masson染色观察各组小鼠肾脏的纤维化的改变；免疫组织化学法检测各组小鼠组织内Smad7、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、E-Cad、α-SMA、Smurf1、Smurf2、P-Smad3、Smad3、P-Smad2/3、Smad2/3、Ubiquitin（Ub）蛋白的表达情况；Westernblot（WB）法定量检测Smad7、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、E-Cad、α-SMA、Smurf1、Smurf2、P-Smad3、Smad3、P-Smad2/3、Smad2/3、Ubiquitin（Ub）蛋白表达情况；RT-PCR法定量检测Smad7、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、E-Cad、α-SMA、Smurf1、Smurf2基因的mRNA表达情况；免疫共沉淀技术检测各组小鼠肾脏组织中TβR-Ⅰ-Smad2、TβR-Ⅰ-Smad3、TβR-Ⅰ-Smurf2、TβR-Ⅰ-TβR-Ⅱ之间的结合程度。<br>　　2、利用液质联用色谱（LC-MS/MS）技术对各组小鼠的血清进行非靶向代谢组学分析，研究肾间质纤维化模型小鼠和肾康注射液处理组小鼠血清样本，筛选出与肾纤维化相关的差异代谢物，并通过KEGG通路富集分析其差异代谢通路与TGF-β/Smad信号通路之间的关系。<br>　　3、采用CCK-8法检测肾康注射液1:10至1:100000稀释度对肾小管上皮细胞HK-2活性的影响，从而明确肾康注射液在HK-2细胞中的安全浓度范围，选取三个浓度作为后续干预HK-2细胞的实验浓度。<br>　　4、使用TGF-β1诱导HK-2细胞转分化（EMT）并给予肾康注射液进行干预，利用倒置显微镜观察细胞细胞转分化（EMT）的情况；免疫荧光+倒置荧光显微镜检测EMT（α-SMA、E-cadherin）标志物、TGF-β/Smad信号分子中Smurf1/2-Smad7、Smurf1-TβR-Ⅰ、Smurf2-Smad2的表达与定位情况；Westernblot（WB）法定量分析Smad7、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、E-Cad、α-SMA、Smurf1、Smurf2、P-Smad3、Smad3、P-Smad2/3、Smad2/3、Ubiquitin（Ub）蛋白表达情况；RT-PCR法定量检测Smad7、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、E-Cad、α-SMA、Smurf1、Smurf2基因的mRNA表达情况。<br>　　5、通过质粒转染的方法，将Myc-TβR-Ⅰ或TβR-Ⅱ、Flag-Smurf1、HA-Ub共转染至HK-2细胞内，同时给予TGF-β1刺激，并给予肾康注射液干预，通过免疫共沉淀+Westernblot法观察并检测TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smurf1、Ub蛋白的表达与结合情况。<br>　　6、通过质粒转染的方法，将Flag-Smurf2、Myc-Smad2、HA-Ub共转染至HK-2细胞内，同时给予TGF-β1刺激，并给予肾康注射液干预，通过免疫共沉淀+Westernblot法观察并检测Smurf2、Ub、Smad2蛋白的表达与结合情况。<br>　　7、通过免疫共沉淀实验，观察肾康注射液对TβR-Ⅰ或TβR-Ⅱ与Smad2或Smad3之间交互的影响。<br>　　结果：<br>　　1、肾康注射液可改善UUO模型小鼠的肾功能并促进体重的恢复；通过对患侧肾脏进行HE和Masson染色，结果显示肾康注射液可减轻肾小管萎缩和扩张、肾小管数量减少、囊性扩张肾小管上皮细胞凋亡、炎性细胞浸润及肾间质纤维化的面积，降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的合成，并抑制EMT标志性蛋白α-SMA的表达，增加E-Cad的表达。在免疫组织化学、Westernblot及RT-PCR实验中，肾康注射液治疗降低了UUO模型小鼠TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad2、P-Smad2/3的表达，促进Smad7、Smurf2、Smurf1、Ubiquitin的表达，抑制TβR-Ⅰ-Smad2、TβR-Ⅰ-Smad3、TβR-Ⅰ-Smurf2、TβR-Ⅰ-TβR-Ⅱ之间的结合。<br>　　2、肾康注射液对UUO模型小鼠的血清代谢物所涉及的关键途径是胆汁分泌途径、维生素B6的新陈代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢、类固醇代谢、苯丙氨酸代谢、磷酸肌醇代谢、甾类激素生物合成、嘌呤代谢、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸及天冬氨酸代谢、丙酮酸代谢、烟酸及烟酰胺代谢、碳水化合物的消化及吸收、α?亚麻酸的新陈代谢、精氨酸及脯氨酸的代谢、蛋白质消化吸收、柠檬酸循环(TCA循环)通路，肾康注射液可通过负调控TGF-β/Smad信号通路来恢复UUO模型小鼠肾间质纤维化小鼠脂质代谢、氨基酸代谢及嘌呤代谢的紊乱。<br>　　3、肾康注射液各浓度对HK-2细胞的存活率影响分别为14.92%、13.12%、91.78%、110.62%、107.11%、105.39%、97.48%、104.31%、109.07%、109.46%。因此，分别筛选出1:40、1:80、1:100作为肾康注射液的高、中、低浓度（SKI-H、SKI-M、SKI-L）。经肾康注射液高、中、低浓度处理的正常HK-2细胞，其TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的mRNA表达降低，而Smad7、Smurf1、Smurf2的mRNA增加。不同浓度的肾康注射液干预经TGF-β1处理的HK-2细胞后，结果显示肾康注射液可降低α-SMA蛋白的表达，增加E-Cad蛋白的表达，抑制HK-2细胞EMT的作用，并降低了TGF-β1处理的HK-2细胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad2、P-Smad2/3的表达，促进Smad7、Smurf2、Smurf1、Ubiquitin的表达。<br>　　4、肾康注射液处理后的HK-2细胞，显著抑制了TβR-Ⅰ-TβR-Ⅱ、TβR-Ⅰ/Ⅱ-Smad2、TβR-Ⅰ/Ⅱ-Smad3、TβR-Ⅰ/Ⅱ-Smad2/3之间的结合。<br>　　5、肾康注射液可增加TGF-β1诱导的HK-2细胞中Smurf1、Smurf2、Smad7的荧光强度，并促进Smurf1-Smad7、Smurf2-Smad7的核易位。<br>　　6、在过表达Myc-TβR-Ⅰ、Flag-Smurf1、HA-Ub和Myc-Smad2、Flag-Smurf2、HA-Ub的HK-2细胞中，肾康注射液促进了Smad泛素连接酶Smurf2-Smad2、Smurf1-TβR-Ⅰ之间的结合，使TβR-Ⅰ、Smad2分别被Smurf1、Smurf2泛素化降解。<br>　　结论：<br>　　1、肾康注射液可改善UUO模型小鼠的肾功能、肾脏病理组织损伤，缓解肾间纤维化。<br>　　2、肾康注射液可通过促进UUO模型小鼠中Smad泛素连接酶Smurf1、Smurf2的表达来负调控TGF-β/Smad信号通路，抑制肾小管上皮细胞EMT，从而逐渐恢复紊乱状态的UUO模型小鼠脂质代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢。<br>　　3、肾康注射液通过促进Smurf1、Smurf2的核易位，并促进分别Smurf1、Smurf2与TβR-Ⅰ、Smad2结合，介导TβR-Ⅰ、Smad2的泛素化降解，进而抑制TβR-Ⅰ/TβR-Ⅱ、TβR-I/Smad2、TβR-Ⅰ/Smad3复合物的形成来调控TGF-β/Smad信号通路诱导的肾小管上皮细胞的EMT。