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摘要研究背景和目的：<br>　　肌病是一种骨骼肌功能异常的一种临床疾病，骨骼肌再生功能的减退是许多肌病恶化的重要影响因素。研究发现中药穿心莲的主要有效成分穿心莲内酯对肌病模型小鼠的骨骼肌病理症状具有改善作用，但穿心莲内酯对骨骼肌再生的作用和作用机制仍不明确。本研究的主要目的是探究穿心莲内酯对骨骼肌再生的作用及其对组蛋白甲基化调控的肌再生机制，为进一步开发穿心莲内酯的临床应用提供理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　第一部分<br>　　1.穿心莲内酯对小鼠骨骼肌损伤后再生的组织病理学影响<br>　　C57/BL6小鼠随机分为假手术组（空白组）、模型组和穿心莲内酯组。穿心莲内酯（10mg/kg）腹腔注射预给药一周，通过肌肉注射Cardiotoxin（10μM）20μL以建立骨骼肌急性损伤模型。采用穿心莲内酯持续治疗三周，分别在模型建立后第1、3、7、21天取材，4%PFA固定。石蜡包埋切片后进行Hamp;E染色，采图并统计分析新生肌纤维平均个数、横截面直径和面积；<br>　　2.穿心莲内酯对小鼠原代卫星细胞和C2C12细胞增殖和迁移的影响<br>　　分离并培养小鼠原代卫星细胞，通过CCK-8检测0.1μM、0.5μM、1.0μM、5.0μM、10μM和20μM穿心莲内酯对卫星细胞和C2C12小鼠成肌细胞活性的影响；采用穿心莲内酯（1μM）处理卫星细胞和C2C12细胞，进行细胞计数实验和WesternBlot检测PCNA蛋白的表达、RealTime-PCR检测小鼠卫星细胞和C2C12细胞周期相关基因的转录水平；免疫组化检测小鼠肌组织中Ki67、PCNA蛋白的表达；细胞划痕实验检测穿心莲内酯对卫星细胞和C2C12细胞迁移的影响。<br>　　3.穿心莲内酯对肌细胞分化融合的影响<br>　　分别采用含有10%FBS和2%马血清的培养基对卫星细胞和C2C12细胞进行正常培养和诱导分化培养，RealTime-PCR检测穿心莲内酯处理后细胞中的肌分化融合基因的转录水平变化；免疫组化检测小鼠新生肌纤维中MyoD、Myosin蛋白的表达水平；诱导C2C12细胞分化融合形成肌管，并进行免疫荧光染色检测Myosin蛋白的表达。<br>　　第二部分<br>　　1.穿心莲内酯对肌细胞组蛋白甲基化的影响<br>　　WesternBlot检测不同浓度的穿心莲内酯处理C2C12细胞和穿心莲内酯处理卫星细胞后不同时间段的组蛋白H3K4和H3K36甲基化水平；免疫组化检测小鼠新生肌纤维中H3K4Me2/3的表达水平。<br>　　2.穿心莲内酯对甲基化抑制后的肌细胞分化和融合的影响<br>　　采用组蛋白甲基化抑制剂DZNeP抑制小鼠卫星细胞和C2C12细胞，并通过RealTime-PCR检测组蛋白甲基化被抑制后穿心莲内酯对肌分化融合基因的影响；采用2%马血清诱导C2C12细胞形成肌管，同时加入DZNeP抑制剂，进行结晶紫染色，观察肌管形成数量。<br>　　研究结果：<br>　　第一部分<br>　　1.穿心莲内酯促进骨骼肌的再生<br>　　Hamp;E染色结果显示，造模后第一天受损骨骼肌中发生炎症细胞浸润，肌纤维溶解；第三天受损肌纤维基本被清除，出现大量细胞聚集；第七天以中央细胞核为特征的新生肌纤维出现，且给药组完整新生肌纤维的数量多于模型组；第二十一天，受损肌纤维基本修复完成，给药组新生肌纤维的横截面直径和面积优于模型组。<br>　　2.穿心莲内酯对肌细胞的增殖和迁移无明显作用<br>　　CCK-8检测结果显示，穿心莲内酯浓度大于1μM后细胞活性下降；细胞计数显示穿心莲内酯对卫星细胞的增殖数目无明显影响；WesternBlot结果显示穿心莲内酯对C2C12细胞PCNA蛋白的表达无明显作用；RealTime-PCR和免疫组化结果显示，给药组和模型组细胞周期调控基因的转录水平以及PCNA和Ki67蛋白的表达无明显差异。<br>　　3.穿心莲内酯促进肌细胞的分化和融合<br>　　RealTime-PCR检测分析发现穿心莲内酯组肌分化基因的转录水平高于对照组，且给药后C2C12细胞形成肌管的数目较多且Myosin的荧光信号增强；免疫组化结果显示给药组的MyoD、Myosin蛋白的表达水平有所提高。<br>　　第二部分<br>　　1.穿心莲内酯上调肌细胞中的组蛋白H3K4的甲基化水平<br>　　WesternBlot结果显示给药组H3K4水平高于对照组，且随处理时间的延长而增加，并呈现出浓度依赖性；<br>　　2.穿心莲内酯可能通过组蛋白H3K4甲基化途径促进肌细胞的分化和融合<br>　　RealTime-PCR检测结果显示采用DZNeP抑制组蛋白甲基化后，穿心莲内酯组肌分化基因的转录水平受到抑制，且C2C12诱导分化实验结果显示组蛋白甲基化被抑制后给药组的肌管数目减少。<br>　　结论：本课题的研究结果表明穿心莲内酯可促进小鼠骨骼肌再生，其机制可能是通过调控组蛋白H3K4甲基化上调肌分化基因的转录以促进肌细胞的分化和融合。