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摘要蛇毒是一类由多肽和蛋白质组成混合物，由毒腺细胞分泌并储存于毒腺中，常被用于抗蛇毒血清制备、组分功能研究以及潜在活性药物筛选。传统采集蛇毒需要捕获并豢养大量的野生毒蛇，这样做不利于野生动物资源的保护；通过咬膜、负压等方法提取毒液的过程需要手动控制动物头部或挤压其头部两侧毒腺，操作人员可能因操作不慎被毒蛇咬伤。毒腺细胞培养是体外获取蛇毒组分的途径之一，通过建立持久传代细胞系或模型，有望弥补传统蛇毒采集的不足，但是国内外相关研究较少。<br>　　本研究共包括三个部分：1）在27、32和37℃三个温度下培养短尾蝮（Gloydius brevicaudus）成体与幼体（含一年龄和新生幼体）、尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）幼体和舟山眼镜蛇（Naja atra）幼体毒腺细胞，同时在32℃下培养了福建绿蝮（Viridovipera stejnegeri）成体和银环蛇（Bungarus multicinctus）成体毒腺细胞，旨在探讨温度、年龄对毒腺细胞生长增殖的影响。2）通过双抗体夹心ELISA对毒腺细胞培养产物中的蛇毒组分的含量进行检测。3）使用LC-MS/MS鉴定原代培养了54天的舟山眼镜蛇和银环蛇毒腺细胞所分泌的毒素组分，并与动物自然状态所排出毒液的蛋白组构成特征进行比较。主要研究结果如下：<br>　　在27℃下，一年龄短尾蝮幼体毒腺细胞前期快速生长聚集形成中间透明的小球样结构，中后期细胞生长速度变慢；短尾蝮成体、尖吻蝮幼体和舟山眼镜蛇幼体毒腺细胞在整个生长过程中生长速度没有明显的变化，且在前期有少量小球样结构出现。在32℃下，一年龄短尾蝮幼体毒腺细胞快速生长，中后期形成少量小球样结构；短尾蝮成体、尖吻蝮幼体、舟山眼镜蛇幼体毒腺细胞前期聚集形成少量的小球样结构，中后期细胞继续生长。37℃下所有物种的毒腺细胞下均无法生长。此外，32℃下福建绿蝮成体毒腺细胞前期聚集形成少量直径较大的小球样结构，但中后期直径变小、数量增多。银环蛇成体毒腺细胞前期聚集形成少量直径较小的小球样结构，但是中期直径逐渐变大，数量变多。后期小球样球体的直径进一步变大，数量增多。新生短尾蝮幼体毒腺细胞生长增殖的速度较快，能够形成大量直径较大的小球样结构。相比之下，一年龄短尾蝮幼体毒腺细胞和短尾蝮成体毒腺细胞生长速度比较慢。实验结果证明毒腺细胞的生长增殖的能力与物种、培养温度和年龄均有关。<br>　　检测32℃培养6、12、18、24和30天时五种毒蛇毒腺细胞分泌产物中的毒液含量显示，短尾蝮毒腺细胞培养产物中毒液浓度在第6天时最高，为12.4ng/mL，在第18天时最低，为3.9ng/mL；尖吻蝮毒腺细胞培养产物中毒液浓度在培养第6天时最高，为192.4ng/mL，培养第30天时最低，为15.4ng/mL；舟山眼镜蛇毒腺细胞培养产物中毒液含量最多，培养第24天浓度最高，为11541.9ng/mL，第6天浓度最低，为3667.6ng/mL；福建绿蝮毒腺细胞培养产物中毒液浓度在培养第30天时最高，为456.3ng/mL，在第12天时浓度最低，为193.4ng/mL；银环蛇毒腺细胞培养产物中毒液浓度在培养第6天时最高，为359.7ng/mL，第30天时浓度最低，为38.5ng/mL。因此，不同物种毒腺细胞培养产物中蛇毒浓度不同，同一物种毒腺细胞培养产物中蛇毒浓度在不同阶段也存在一定的差异。<br>　　直接质谱比较毒腺细胞分泌毒液与传统方法采集毒液的蛋白组构成特征发现，包埋于基质胶中原代培养54天的舟山眼镜蛇毒腺细胞培养样品与传统采集的舟山眼镜蛇毒液分别含有8种和15种蛇毒蛋白家族组分，且主要组分均为短链神经毒素，分别占总量的62.6%和84.9%；银环蛇毒腺细胞培养样品与传统采集的银环蛇毒液分别含有5种和14种蛇毒蛋白，但前者以短链神经毒素（79.5%）为主，后者以长链神经毒素（45.1%）为主，且短链神经毒素仅占总量的13.9%。总体而言，毒腺细胞培养产物所含毒素类型要少于传统方法采集的蛇毒，且组分的相对含量也存在一定程度的差异。<br>　　本文成功培养了毒腺细胞，并在毒腺细胞的培养产物中检测到了蛇毒组分，同时动物自然状态所排出毒液中的部分蛋白成分也在培养后期的毒腺细胞样品中被鉴定出来。这一实验结果证明可以通过毒腺细胞的培养获得蛇毒组分，毒腺细胞培养初期出现的小球样结构已初具类器官形态特征，但仍需通过转录组分析、单细胞RNA测序分析以及免疫组化等方法予以验证。