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摘要背景：<br>　　脑缺血是由流向大脑的血流扰动引起的，这些扰动会触发连续和复杂的代谢和细胞病变，对于急性缺血性卒中（AcuteIschemiaStroke，AIS）患者给予静脉溶栓并结合机械取栓，这样的治疗手段会引起脑缺血再灌注损伤，分析其潜在的生物学机制，为神经元死亡的治疗提供新的切入点。由于海马神经元对缺糖缺氧较为敏感，即使是短期缺乏葡萄糖和氧气也会对神经元细胞造成极大的损害，在某些情况下甚至会导致细胞死亡。实验室对小鼠海马神经元细胞（HT22细胞）进行缺糖和缺氧处理模拟脑缺血损伤。<br>　　线粒体可以生成ATP为细胞提供能量。线粒体内蛋白酶HtrA2/OMI、LONP、CLPP等，可使线粒体内未折叠蛋白反应（UPR）增强，去除多余的蛋白质恢复线粒体的功能，对于维持细胞稳态发挥重要的作用。线粒体功能障碍与线粒体不能满足细胞对ATP需求有关，并且活性氧生成增强。当线粒体受到损伤时，会导致线粒体内蛋白酶HtrA2/OMI等从线粒体释放出来，从而裂解XIAP，促进凋亡的发生。<br>　　研究表明，当蛋白质发生损坏时会对内质网(ER)稳态产生不利影响，从而导致ER应激，这反过来启动了未折叠蛋白反应(UPR)，这是一种整合的细胞内信号通路，通过增加ER分子伴侣的表达、减弱整体蛋白质翻译和降解未折叠蛋白来响应ER应激，当内质网受损伤时会激发PERK/eIF2α-ATF4-ATF5-CHOP经典途径引起内质网应激。<br>　　线粒体自噬的经典途径为PINK/PARKIN途径。当线粒体膜电位下降时，PINK在线粒体外膜上表达，募集磷酸化的PARKIN进而结合泛素基团，进而结合线粒体自噬相关蛋白引起自噬，清除不健康的线粒体。线粒体是一种重要的细胞器，在不同的生命功能中起着关键作用，例如能量产生、Ca2+稳态、碳代谢、细胞生长中间体的产生以及诱导细胞凋亡。<br>　　研究目的：<br>　　本研究通过复制HT22小鼠海马神经元细胞缺糖缺氧模型，以线粒体应激和内质网应激为切入点，探讨内质网和线粒体应激共同诱导线粒体自噬在细胞损伤过程中发挥的保护作用。<br>　　研究方法：<br>　　通过对HT22细胞进行缺氧糖剥夺处理用无糖的DMEM培养基在缺氧箱（O20.5%，CO25%）同时加Genipin处理分为Con组、OGD组、OGD+Genipin组。<br>　　1.通过MTT、流式细胞仪检测凋亡、Hoechst染色检测细胞核形态、WesternBlot检测凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、c-caspase3的蛋白表达水平评估细胞的损伤情况。<br>　　2.通过流式细胞仪JC-1染色检测线粒体的膜电势以及ROS，荧光显微镜观察线粒体内ROS，用WesternBlot分别检测线粒体、胞浆及总蛋白中丝氨酸蛋白酶HtrA2/OMI线粒体蛋白酶LONP、CLPP的蛋白表达情况评估线粒体状态。<br>　　3.通过WesternBlot检测PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、ATF5内质网应激相关蛋白，评估内质网应激情况。<br>　　4.通过WesternBlot检测UCP2、PINK、PARKIN、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62等蛋白表达情况；加入自噬通量阻断剂氯喹(CQ)后，用WesternBlot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白表达情况、流式细胞仪检测线粒体的数量，评价线粒体自噬通量是否通畅；IP检测UCP2、PARKIN、ATF4的蛋白表达情况，评估线粒体自噬与线粒体应激以及内质网应激的关系。<br>　　结果：<br>　　1.加入Genipin后，OGD+Genipin组细胞生存能力上升；流式细胞术检测细胞凋亡，OGD+Genipin组细胞凋亡率下降；Hoechst染细胞核后荧光显微镜显示，处理组核固缩、核碎裂形态减少；Westernblot蛋白检测凋亡相关蛋白BAX以及下游c-caspase3，处理组表达量上升，在OGD+Genipin组表达下降，抗凋亡蛋白BCL-2在OGD+Genipin组表达上升。<br>　　2.流式细胞仪检测JC-1、ROS结果显示，加入Genipin后线粒体膜电势提升，ROS的生成减少，荧光显微镜显示线粒体内ROS明显减少；WesternBlot检测线粒体蛋白结果显示，加入Genipin后BAX表达降低，BCL-2表达上升，而总蛋白以及线粒体蛋白结果显示，HtrA2/OMI、线粒体蛋白酶LONP、CLPP在OGD组表达上升，在OGD+Genipin组表达进一步上升。<br>　　3.WesternBlot检测总蛋白中PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、ATF5、CHOP，在加药后表达上升更加明显，检测线粒体蛋白ATF5发现加药后表达上升更加明显。<br>　　4.WesternBlot检测总蛋白和线粒体蛋白，UCP2在处理后表达上升，加药后表达下降，线粒体自噬相关蛋白PINK、PARKIN、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在处理后表达上升，在加药后上升更加明显，P62蛋白表达变化不明显，线粒体蛋白内p-UB在处理后表达上升，加药后表达上升更加明显。RT-qPCR检测UCP2在处理后表达上升，在加药后表达下降，PINK的mRNA在处理后表达下降，加药后表达下降更明显，PARKIN、LC3Ⅱ、P62mRNA在处理后表达量上升，加药组表达上升更加明显。加入CQ后，发现LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白表达量con+CQ组与con组变化不明显，OGD+CQ组与处理组以及OGD+Genipin+CQ组与加入Genipin后相比上升明显；用流式细胞仪检测线粒体数量，加入CQ后线粒体数量明显上升。蛋白免疫共沉淀IP结果显示较少的UCP2结合较多的PARKIN和ATF4，同时随着ATF4表达增加结合的PARKIN也增加，结合的UCP2更少。<br>　　结论：<br>　　1.Genipin通过抑制细胞凋亡，提升缺氧糖剥夺处理后的HT22细胞活力。<br>　　2.Genipin通过提高线粒体膜电势，增加线粒体内HtrA2/OMI的表达，提升线粒体应激反应，维持线粒体的功能。<br>　　3.Genipin通过调控PERK/eif2α，激活内质网应激反应，促进细胞存活。<br>　　4.Genipin抑制UCP2的表达增强线粒体应激和内质网应激，通过UCP2-ATF4-PARKIN途径共同调控线粒体自噬，从而减轻HT22细胞的损伤。