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摘要淋巴系统是脉管系统的主要组成部分，在脂质吸收、维持组织液平衡和免疫监测等方面发挥着至关重要的作用。淋巴系统的病变与心血管疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病、炎症以及恶性肿瘤等多种系统性疾病的发生发展密切相关。然而，较于血管系统疾病诊疗技术的快速发展，淋巴系统疾病由于受制于可视化技术的障碍，对其病理特征的检查和相关病变症状的早期筛查技术的发展还处于起步阶段。因此，建立高效且能够对淋巴系统实时成像的监测体系对于医学领域就有着显著的意义。<br>　　吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）是一种近红外荧光染料，具有与血浆蛋白结合率高，不被肝外组织吸收的特点，更重要的是，ICG作为目前唯一被美国食品药品管理局（FDA）批准临床使用的近红外光荧光染料，已经在临床使用超过50年，具有较好的安全性。近年来，ICG近红外荧光显像已被广泛用于淋巴水肿疾病的早期诊断、临床分期、术中导航及预后监测，并逐渐成为研究浅表淋巴系统功能状态的最佳方法。<br>　　目的：<br>　　尽管ICG在淋巴成像领域得到了广泛的应用，但ICG存在以下不足：（1）无淋巴靶向性。由于ICG的分子尺寸小，皮下注射后同时进入毛细静脉血管（内皮间隙＜4nm）和毛细淋巴管（内皮间隙30～120nm），显像多呈弥散型、星辰型，对浅表淋巴系统显影造成干扰；（2）物理化学性质不理想，如稳定性差、自猝灭和量子产率低等；（3）淋巴组织显影深度受限（＜2cm）。上述缺陷限制了近红外淋巴造影技术的全部潜力。因此，研发基于ICG的，具有淋巴管靶向性、荧光强度增强、稳定性好且生物安全性高的淋巴系统特异性显影剂，将对淋巴系统相关疾病的临床诊疗具有重大意义，这也是本论文的研究目的。<br>　　方法：<br>　　针对上述问题，我们使用的主要实验方法为，设计不同结构和功能的纳米颗粒载体，并以此装载ICG分子，通过一系列的后修饰，制备了两种新型的纳米粒子光学成像剂。以期能够改善ICG的淋巴管靶向性和增强ICG荧光强度与稳定性这两个方向对ICG的成像性能进行改进。具体的研究内容如下：<br>　　1、FDA批准的小分子染料ICG已广泛应用于淋巴管成像。然而，这种小分子的成像剂在进入淋巴系统后，并未显示出选择性的结合能力，会同时进入毛细静脉血管和毛细淋巴管，对成像结果产生干扰；同时，小分子的ICG在体内的半衰期很短，会很快的被人体组织清除。因此，本论文首先选择了平均粒径为90nm的氨基化可自降解的有机介孔硅，以此为载体，将羧基化的ICG连接在上面；随后利用介孔硅表面剩余的氨基，进一步在介孔硅表面修饰透明质酸（hyaluronic acid,HA）。利用介孔硅负载ICG实现成像体系尺寸变大；在介孔硅表面修饰的透明质酸，可以与淋巴管内部分布的淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1（LYVE-1）相互作用，提高了成像体系在淋巴管内的成像特异性和停留时间；同时，该体系的生物兼容性好，七天内可降解，生物安全性高。<br>　　2、随后利用MTT法检测了ICG@HMONs-HA的细胞毒性，且与另外三种与ICG@HMONs-HA尺寸相当的市售纳米材料进行了比较；选择了三种有代表性的细胞考察了ICG@HMONs-HA对淋巴管内皮细胞的选择性；最后为了进一步证明ICG@HMONs-HA的靶向作用，制备了小鼠腿部组织的切片，并用共定位荧光染色进行了研究。<br>　　3、由于结构上的天然缺陷，ICG在体内成像时还存在着稳定性差、自猝灭和量子产率低等问题。针对上述缺陷，我们有针对性的设计合成了一种多孔有机聚合物（POP）作为改善ICG成像功能的纳米载体。POP由于具有开放的结构、优异的稳定性和可调的结构组成，在荧光成像领域显示出巨大的应用潜力。本论文针对吲哚菁绿分子同时含有磺酸基团和共轭片段的特征性结构，制备了氨基接枝的多孔聚合物。随后将ICG装载于POP内，考察了ICG的稳定性与荧光发光性质的改善。<br>　　4、随后利用MTT法检测了ICG-POP-HA在不同浓度时的细胞毒性；选择了三种有代表性的细胞考察了ICG-POP-HA对淋巴管内皮细胞的选择性；最后为了进一步证明ICG-POP-HA的靶向作用，制备了小鼠腿部组织的切片，并用共定位荧光染色进行了研究。<br>　　结果：<br>　　1、利用TEM，DLS和zeta电势等表征手段，证明了ICG@HMONs-HA材料的正确合成；紫外-可见光光谱测定表明，ICG@HMONs-HA的光学性质没有发生明显的变化；模拟生理条件的降解性实验表明，ICG@HMONs-HA在生理条件下可自发生物降解，这也保证了ICG@HMONs-HA在生物体内的安全性，为其在淋巴管成像中的应用奠定了基础。<br>　　2、首先利用MTT法检测了ICG@HMONs-HA的细胞毒性。实验结果显示，即使当ICG@HMONs-HA的浓度高达2.0mg/ml时，仍未观察到明显的细胞毒性。且与另外三种与ICG@HMONs-HA尺寸相当的市售纳米材料相比，ICG@HMONs-HA的生物安全性依旧是最好的，这也为ICG@HMONs-HA的生物应用提供了前提条件。接下来为了考察ICG@HMONs-HA对淋巴管内皮细胞的选择性，我们选择了三种细胞来进行研究，分别为小鼠正常淋巴管内皮细胞（MLEC）、小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和小鼠结肠癌细胞（CT26）。实验结果显示，当使用ICG@HMONs-HA对细胞进行染色时，既可以观察到细胞的选择性（与MLEC特异性结合），也可以体现出与细胞的牢固结合（不易于被清洗）。这说明ICG@HMONs-HA通过修饰在表面的透明质酸和LYVE-1之间产生了强亲和力，由此促进了ICG@HMONs-HA对淋巴管内皮细胞产生明显的特异性识别能力和驻留能力，使之更适用于进行淋巴管成像。为了进一步证明ICG@HMONs-HA的靶向作用，我们制备了小鼠腿部组织的切片，并用ICG@HMONs-HA和LYVE-1抗体进行共定位荧光染色，实验结果表明ICG@HMONs-HA可以靶向结合到淋巴管区域。<br>　　3、针对吲哚菁绿分子同时含有磺酸基团和共轭片段的特征性结构，制备了氨基接枝的多孔聚合物。所得NH2-POP多孔聚合物具有集中在1.2和3.5nm的孔径尺寸。3.5nm的介孔孔道为吲哚菁绿分子在粒子内部的快速传输提供了大的孔道空间，而1.2nm的微孔尺寸能够通过静电键合和π-π相互作用的协同效应，将ICG紧密地结合到POP固体的孔隙中。更重要的是，ICG-POP复合物可以显著提升ICG的荧光强度，并大幅提升ICG的稳定性。我们在得到可以显著提升ICG荧光强度的ICG-POP复合物后，利用POP表面剩余的氨基，进一步在POP表面修饰透明质酸，得到ICG-POP-HA复合成像剂，以期增强成像剂与淋巴管内部的LYVE-1的相互作用，提高了成像剂在淋巴管内的成像特异性和停留时间。<br>　　4、首先利用MTT法检测了ICG-POP-HA的细胞毒性。实验结果显示，即使当ICG-POP-HA的浓度高达5.0mg/ml时，仍未观察到明显的细胞毒性。接下来为了考察ICG-POP-HA对淋巴管内皮细胞的选择性，我们选择了三种细胞来进行研究，分别为小鼠正常淋巴管内皮细胞（MLEC）、小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和小鼠结肠癌细胞（CT26）。实验结果显示，当使用ICG-POP-HA对细胞进行染色时，既可以观察到细胞的选择性，也可以体现出与细胞的牢固结合。同时，通过使用AdobePhotoshopCS3软件进行的定性计算也表明，相比于ICG，ICG-POP-HA对MLEC细胞成像时拥有更高的绿色荧光强度，这表明POP不但可以稳定ICG，还可以提升ICG在成像时的荧光强度。最后我们制备了小鼠腿部组织的切片，并用ICG-POP-HA和LYVE-1抗体进行共定位荧光染色，实验结果表明ICG-POP-HA可以靶向结合到淋巴管区域。该工作为增强ICG的荧光强度与稳定性能力提供了一种实用方法，同时证明了POP基固体纳米材料在荧光成像和生物医学应用中同样拥有巨大的应用前景。<br>　　结论：<br>　　本论文设计并合成了两种新型的基于ICG的淋巴靶向纳米成像剂。其中以介孔硅为载体的ICG纳米成像剂能够提升ICG成像体系在淋巴管内的靶向性和停留时间；以POP为载体的ICG纳米成像剂能够在提升成像剂的靶向性的基础上，进一步增强ICG的荧光强度与稳定性能力。上述工作为改善ICG的成像能力提供了两种实用方法，并为基于纳米材料的淋巴系统成像剂的设计提供了一种新思路。