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摘要背景:<br>　　瘢痕疙瘩(Keloid)作为整形外科的常见病和多发病,是一种病理特征表现为细胞外基质(ECM)过度沉积的良性皮肤肿瘤.目前临床上仍缺乏有效的根治手段,其病因及发病机制还有待深入研究.早期生长反应-1(EGR1)是一种重要的锌指转录因子,被认为是纤维化的关键介质之一.EGR1在多种细胞类型中参与包括细胞增殖、迁移、侵袭、细胞分化及凋亡等诸多重要的生理过程,是皮肤瘢痕预防的潜在靶点.MicroRNAs(miRNAs)是一种长度为18-22个核苷酸的非编码RNA序列.作为表观遗传修饰的重要调控分子,miRNA主要通过参与靶基因转录后调控影响各种病理生理过程,在瘢痕疙瘩的发病机制也中起着至关重要的调控作用.我们利用瘢痕疙瘩基因表达谱数据结合生信分析预测miR-183-5p通过靶向调控EGR1参与瘢痕疙瘩的发生发展.然而,目前miR-183-5p/EGR1在瘢痕疙瘩中的作用机制尚不明确.<br>　　目的:<br>　　观察miR-183-5p/EGR1差异表达对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等表型的影响;证实miR-183-5p与EGR1之间的靶向调控关系,为瘢痕疙瘩精准医疗提供新的理论依据.<br>　　方法:<br>　　本研究以瘢痕疙瘩为研究对象,通过组织块法培养瘢痕疙瘩原代成纤维细胞(KF)及正常皮肤原代成纤维细胞(NF);RT-PCR检测KF及NF中miR-183-5p的表达差异;通过转染miR-183-5p模拟物(mimic)/抑制剂(inhibitor)或pcDNA3.1-EGR1质粒/小干扰RNA(siEGR1)构建miR-183-5p或EGR1差异表达细胞模型;通过CCK-8实验检测细胞增殖情况;通过划痕实验检测细胞迁移能力的变化;通过Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力变化;通过流式细胞术测量细胞凋亡变化.RT-PCR及WesternBlot实验检测EGR1及其他相关基因的表达变化;通过双荧光素酶报告实验证实miR-183-5p与EGR1之间的靶向调控关系.<br>　　结果:<br>　　1.瘢痕疙瘩中miR-183-5p表达下调<br>　　瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织miRNA表达谱芯片检测结果显示:与正常皮肤组织相比,瘢痕疙瘩组织中发现247个miRNA差异表达(134个上调,113个下调)(plt;0.05,倍数变化lt;0.5),其中miR-183-5p在瘢痕疙瘩组织中表达明显下调.组织块法培养人瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织原代成纤维细胞,并利用RT-PCR检测原代细胞中miR-183-5p的表达,结果显示:与NF细胞相比,KF细胞中miR-183-5p的表达显著下调(plt;0.001).<br>　　2.miR-183-5p对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞表型的影响<br>　　通过瞬时转染miR-183-5p模拟物上调其在瘢痕疙瘩原代成纤维细胞(KF)中的表达以进行功能获得性实验,结果显示,miR-183-5p在转染模拟物后24h及48h表达明显上调(plt;0.05).CCK-8实验结果显示:miR-183-5p模拟物组KF在转染后24h、48h及72h生长速度明显滞后于对照组(plt;0.05).划痕实验结果显示:36h后miR-183-5p模拟物组KF迁移率明显小于对照组(plt;0.01).Transwell迁移及侵袭实验结果显示:24h后miR-183-5p模拟物组迁移细胞数明显少于对照组(plt;0.01),侵袭实验结果一致(plt;0.001).流式细胞术检测结果提示:miR-183-5p模拟物组KF凋亡率明显高于对照组(plt;0.05).WesternBlot实验结果提示转染miR-183-5p48h后Caspase3剪切体在蛋白水平表达上调(plt;0.05).<br>　　3.EGR1对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞表型的影响<br>　　通过瞬时转染小干扰RNA(siEGR1)下调瘢痕疙瘩原代成纤维细胞(KF)中EGR1的表达,RT-PCR及WesternBlot验证沉默效率.随后进行功能获得性实验,CCK-8实验结果显示:siEGR1组KF在转染后24h、48h及72h生长速度明显滞后于对照组(plt;0.05).划痕实验结果显示:36h后siEGR1组KF迁移率明显小于对照组(plt;0.05).Transwell迁移及侵袭实验结果显示:24h后siEGR1组迁移、侵袭细胞数均明显少于对照组(plt;0.05).流式细胞术检测结果提示:siEGR1组KF凋亡率明显低于对照组(plt;0.001),同时Caspase3剪切体在蛋白水平表达下调(plt;0.05).RT-PCR及WesternBlot检测转染siEGR1后ECM相关基因表达变化,结果提示纤维化相关基因(如CollagenⅠ、CollagenⅢ)在mRNA及蛋白水平均表达下调.<br>　　4.miR-183-5p与EGR1靶向调控关系的研究<br>　　利用生物信息学预测网站预测miR-183-5p与EGR1靶向结合位点,双荧光素酶报告实验验证miR-183-5p能够与EGR13''UTR上的预测位点结合.RT-PCR和WesternBlot实验验证转染miR-183-5p模拟物后,EGR1蛋白及mRNA水平的表达均明显下调,提示miR-183-5p靶向抑制EGR1的表达.为了进一步验证这一结论,我们设计了回返实验.首先,同时转染miR-183-5p模拟物及pcDNA3.1-EGR1,利用RT-PCR和WesternBlot实验检测ECM相关基因的表达,结果显示:单独转染pcDNA3.1-EGR1后ECM相关基因表达上调,同时转染miR-183-5p模拟物及pcDNA3.1-EGR1可以消除pcDNA3.1-EGR1对ECM相关基因表达的促进作用.随后,同时转染miR-183-5pinhibitors及siEGR1下调EGR1及miR-183-5p的表达水平,通过transwell实验检测迁移及侵袭能力的变化,结果显示:转染miR-183-5pinhibitors可以减弱siEGR1对细胞迁移及侵袭能力的抑制作用.<br>　　结论:<br>　　1.miR-183-5p在瘢痕疙瘩中表达下调,过表达miR-183-5p能够抑制瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖,降低细胞迁移及侵袭能力,同时促进细胞凋亡.<br>　　2.沉默EGR1可显著抑制瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡,同时下调细胞外基质相关基因的表达.<br>　　3.miR-183-5p能够与EGR1的3''UTR结合,通过靶向抑制EGR1参与调节瘢痕疙瘩的发生发展.