检索历史 清除

摘要目的：由于实体瘤细胞大多处于低氧环境，低氧在肿瘤发生和发展中的详细机制还有待进一步研究。虽然目前关于低氧和肿瘤细胞糖代谢的研究较多，但目前文献主要是针对Warburg效应中提到的糖的有氧酵解或者针对糖代谢途径中一些关键酶来进行研究。本文采用2种三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）细胞和2种低氧细胞模型来模拟TNBC细胞中的低氧环境，并结合转录组测序技术（RNA-Sequencing，RNA-seq）完整地探讨了低氧对TNBC细胞6条糖代谢途径中所有酶基因（包括亚基）及其同工酶和2种重要调节酶基因的表达以及糖代谢途径产物含量的影响，更加全面地证实了低氧对TNBC细胞糖代谢途径的重编程过程。<br>　　方法：采用常氧、2%O2和100μmol/L的CoCl2的条件分别培养BT549和MDA-MB-231两种TNBC细胞后进行RNA-seq；对RNA-seq数据进行质控后采用生物信息学技术来对RNA-seq结果分析；Western印迹检测相关酶蛋白的表达；采用葡萄糖测定试剂盒和乳酸测定试剂盒检测葡萄糖摄入量和乳酸生成量；采用丙酮酸脱氢酶活性测定试剂盒检测丙酮酸脱氢酶活性；采用ATP含量检测试剂盒检测ATP含量；采用NADP+/NADPH测定试剂盒检测NADPH含量；采用糖原含量检测试剂盒检测糖原含量；利用Oncomine数据库分析糖代谢酶基因在乳腺癌组织中mRNA的表达水平；利用Breast Cancer Gene-Expression Miner v4.8数据库分析糖代谢酶的mRNA在TNBC患者中的表达水平。<br>　　结果：1.两种低氧细胞模型的建立<br>　　BT549和MDA-MB-231细胞在2%O2和100μmol/L的CoCl2中处理24h后均观察到HIF-1α和CA9蛋白质的表达比常氧组增加明显，说明低氧模型构建成功。将同时进行常氧和2种低氧处理的BT549和MDA-MB-231细胞送华大基因公司进行测序。公司对送测的24个样本质量和测序结果进行了质控分析，分析结果均为良好。<br>　　2.两种TNBC细胞中物理低氧模型的差异表达基因分析<br>　　与常氧组相比，BT549细胞的物理低氧组中有249个基因表达上调，85个基因表达下调，MDA-MB-231细胞的物理低氧组中有181个基因表达上调，34个基因表达下调，其中在2种细胞中都共同表达改变的基因有64个。通过GO和KEGG富集分析这些共同表达改变的基因，发现物理低氧主要调控BT549和MDA-MB-231细胞糖代谢相关通路。<br>　　3.两种TNBC细胞中化学低氧模型的差异表达基因分析<br>　　与常氧组相比，化学低氧组BT549细胞中有650个基因上调，744个基因下调，MDA-MB-231细胞中的化学低氧组中有35个基因上调，3个基因下调，其中在2种细胞中都共同表达改变的基因有30个。通过GO和KEGG富集分析这些共同表达改变的基因，发现化学低氧也主要调控BT549和MDA-MB-231细胞糖代谢相关通路。<br>　　4.TNBC细胞中2种低氧模型的差异表达基因分析<br>　　分别将这2种TNBC细胞的物理和化学低氧组差异表达基因取交集。BT549细胞的韦恩图显示，2种低氧模型共同表达的基因有103个，而MDA-MB-231细胞只有34个。分别对这些共同表达基因进行聚类热图分析，结果显示共同表达的基因表达大多被上调。两种TNBC细胞的富集途径主要集中在糖代谢相关通路。对BT549和MDA-MB-231细胞进行蛋白质网络互作（protein-protein interaction networks，PPI）分析，MDA-MB-231细胞中PDK1、PGK1、CA9、HK2、BNIP3和PFKFB3是连接最紧密的分子，除上述分子外，BT549细胞的较大节点还有SLC2A1、PTGS2等。<br>　　5.低氧增加2种TNBC细胞葡萄糖的摄取和促进糖的无氧氧化途径在BT549和MDA-MB-231细胞的2种低氧模型中葡萄糖转运蛋白（GLUT1）的mRNA水平表达增加显著，其蛋白质表达水平也一致，并且催化糖的无氧氧化代谢途径全部反应的11种酶在mRNA水平均有不同程度的表达增加，糖的无氧氧化途径每一步反应的酶都选择了一种在mRNA水平表达升高的同工酶或亚基在蛋白质表达水平进行验证，其结果与mRNA表达水平基本一致。而且BT549和MDA-MB-231细胞的2种低氧模型组均会增加葡萄糖摄入量和乳酸生成量。而糖异生途径的4种关键酶在BT549细胞仅有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）在物理和化学低氧组中mRNA水平表达增加。而MDA-MB-231细胞中仅有化学低氧组的丙酮酸羧化酶（PC）在mRNA水平表达增加。<br>　　6.低氧抑制2种TNBC细胞糖的有氧氧化途径<br>　　两种低氧细胞模型中组成丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的3种酶基因在mRNA表达均呈下降趋势，丙酮酸脱氢酶活性降低明显。丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）在BT549和MDA-MB-231细胞的2种低氧模型组中mRNA水平高表达，其在蛋白质水平表达也一致。采用PDK抑制剂二氯乙酸钠处理2种低氧组后丙酮酸脱氢酶活性均上升。催化三羧酸循环途径的大部分酶基因在2种低氧组中mRNA表达水平均呈下降趋势。<br>　　7.低氧促进2种TNBC细胞的磷酸戊糖途径<br>　　磷酸戊糖途径关键酶G6PD在物理低氧处理BT549和MDA-MB-231细胞中mRNA水平表达有所降低，而在化学低氧处理的BT549细胞中mRNA水平表达升高显著，但是G6PD在2种TNBC细胞的2种低氧模型中蛋白质水平表达和NADPH含量均增加。<br>　　8.低氧促进2种TNBC细胞的糖原合成途径<br>　　催化糖原合成的磷酸葡糖变位酶（PGM1）、糖原合酶（GYS1）和分支酶（GBE1）在2种TNBC细胞中的物理和化学低氧组中mRNA水平表达均明显增加，其中糖原合成关键酶GYS1的蛋白质表达在2种TNBC细胞的物理低氧模型中升高显著。而糖原分解途径关键酶糖原磷酸化酶（PYGB）在BT549细胞的物理和化学低氧组中mRNA水平表达略有升高，但是在物理低氧处理的MDA-MB-231细胞中mRNA水平表达却明显降低。<br>　　9.糖代谢途径酶基因在乳腺癌组织中高表达<br>　　Oncomine数据库分析结果显示GLUT1、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO2、PKM、LDHA、PCK2、PDK1、G6PD和GYS1在浸润性乳腺癌组织中mRNA水平的表达显著增加。Breast Cancer Gene-Expression Miner v4.8数据库显示TNBC患者与非TNBC患者相比，糖代谢酶基因GLUT1、PFK1、GAPDH、PGK1、PKM、LDHA、PDK1、G6PD、GYS1和PYGB的mRNA表达水平上调。研究提示，大多数糖代谢酶基因的mRNA水平在TNBC中高表达，与本研究前述细胞实验结果也是一致的。<br>　　结论：本研究全面地分析了低氧对TNBC细胞6条糖代谢途径中所有酶基因（包括亚基）及其同工酶和2种重要调节酶基因的表达以及糖代谢途径产物含量的影响，并通过在线数据库对糖代谢途径酶基因在组织中表达情况进行了分析。可见低氧主要通过增加丙酮酸脱氢酶激酶的酶活性以阻断糖的有氧氧化途径，并通过增加葡萄糖摄入和糖的无氧氧化途径中所有酶的表达以促进糖的无氧氧化途径，同时可能还增强了磷酸戊糖途径和糖原合成途径。综上，低氧环境使三阴性乳腺癌细胞糖代谢途径发生了重编程。此外，本研究应用了2种低氧细胞模型，综合来看物理低氧处理的效果优于化学低氧。