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摘要肿瘤转移是导致九成肿瘤患者死亡的主要原因。随着技术进步，虽然临床上已经能够实现肿瘤转移的早期检测，甚至可以通过癌症筛查等手段在肿瘤转移实际发生之前进行风险预警，但是应对肿瘤转移的临床方案却未能实现有效防治。越来越多的证据表明，由恶性原位瘤分泌的促转移因子能够诱导远端组织中转移前微环境的形成，促进肿瘤定植、支持肿瘤转移灶的发生发展。本研究着眼于转移前微环境的构建过程，提出靶向干预转移前微环境的肿瘤转移防治方案，即在肿瘤转移实际发生之前尽早采取有效手段遏制转移前微环境的形成，实现防治转移的目的。<br>　　本研究首先对肿瘤转移前微环境的病理进程进行了考察，从基质微环境和免疫微环境两方面入手，观测了随着转移前微环境的形成，蛋白和细胞层面上发生的动态变化。检测发现，转移前微环境模型鼠肺组织中聚集分布的高表达α平滑肌肌动蛋白（αSMA+）的激活态成纤维细胞显著增多，胞外基质成分纤维连接蛋白（FN）、基质金属蛋白酶（MMPs）以及促血管生成因子（VEGF）表达水平上调，新生血管增多，由于基质重构和新生血管壁结构不完整等病理特征出现了局部血管渗漏的情况，骨髓来源的免疫抑制性细胞（MDSC）募集持续增多，且多数表现为多核型MDSC（PMN-MDSC），免疫抑制性微环境逐渐形成。<br>　　本研究基于转移前微环境中MMPs高表达的特性，利用多肽自组装特性设计了MMPs响应性后组装多肽FR17，旨在通过体内定点后组装形成特定结构的多肽纳米载体，即多肽自组装体，实现药物递送，干预转移前微环境、调控其形成过程，实现防治肿瘤转移的目的。多肽FR17是支链多肽，由三部分构成：（1）具有自组装折叠性能的主链苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸（Phe-Phe-Lys-Tyr，ffky）；（2）免疫调节药物胸腺五肽（TP5）；（3）能够被MMP2或MMP9识别降解的肽段PLGLAG——在此作为酶响应性连接序列，将TP5连接到ffky的支链上。多肽FR17能够在肺转移前病理微环境中实现酶特异性降解后的自组装，即“响应性后组装”，并释放免疫调控药物。其经酶降解后产生的自组装八肽片段为FG8（ffk(GPLG)y），该片段能够通过分子间氢键和π-π堆积等原子间/分子间作用力组装形成纳米尺寸的薄膜“毯状”自组装体——本研究中将其命名为“多肽纳米毯”。<br>　　为了评估本研究设计的多肽FR17能否阻止转移前微环境形成、防治肿瘤转移，实验构建了具有肺转移前微环境的黑色素瘤肺转移模型，分别在黑色素瘤细胞上清液诱导转移前微环境肺转移模型以及原位瘤切除术后肺转移模型上，对响应性后组装多肽FR17的抗肿瘤转移疗效进行了考察。研究发现，多肽FR17显著抑制了黑色素瘤肺转移，减缓了原位瘤切除术后肺转移的发生，显著延长了模型鼠生存期。上述实验结果一定程度上支持了本研究提出的通过抑制转移前微环境的形成从而抑制肿瘤转移的防治策略。同时，为了研究FR17在转移前微环境中响应性降解产生的两部分序列（即自组装肽段FG8和被递送药物TP5）各自发挥的作用以及作用机制，本研究设计了仅具有响应性后组装性能而不具备免疫调控活性的对照多肽sFD17。多肽sFD17和FR17实现了几乎相同的抑转移效果，即多肽FR17对于黑色素瘤肺转移的抑制作用主要是通过转移前微环境特异性响应后组装形成的“多肽纳米毯”实现的，而相比之下游离药物TP5表现较弱的抑转移作用。因此，本研究深入探讨了未载活性药物的多肽纳米载体——“多肽纳米毯”发挥抗转移作用的机制。<br>　　基于肿瘤转移前微环境的前期研究基础，组织驻留成纤维细胞受肿瘤相关分泌因子（TDSF）调控而激活的过程可以被视为转移前微环境构建的关键转折点。实验结果表明，多肽FR17能受到局部高表达的MMPs触发而发生降解并定点自组装形成“多肽纳米毯”，抑制转移前微环境中成纤维细胞被TDSF持续诱导激活的过程。对照多肽sFD17表现出相近的抑制成纤维细胞激活的能力，其作用主要反映在对过度激活的细胞功能——如增殖活性增加，FN、MMPs、VEGF等促进基质重塑蛋白的转录翻译水平提高，运动迁移和胶原收缩能力增强等的限制。在体内实验中，多肽FR17或sFD17预防性给药大幅降低了转移前微环境模型鼠的肺组织中成纤维细胞激活比例，下调了胞外基质表达，减少了胶原沉积和交联。<br>　　参考肿瘤相关成纤维细胞在调控肿瘤血管新生和基质重构方面的重要作用，本研究进一步探讨了体内形成的“多肽纳米毯”能否通过作用于转移前微环境相关成纤维细胞，影响转移前微环境中血管内皮细胞的行为，进而调控血管新生以及血管完整性。本研究一方面验证了转移前微环境相关成纤维细胞能够通过分泌蛋白对血管内皮细胞增殖、成血管能力和胞间连接等方面进行调控，影响转移前基质微环境和血管完整性。另一方面，也证明了出于“多肽纳米毯”对成纤维细胞的保护作用，即“多肽纳米毯”限制了由TDSF诱导的成纤维细胞激活过程，多肽FR17和sFD17均能有效抑制转移前微环境中血管内皮细胞增殖活性增加，抑制其增强的成血管能力，维持血管内皮细胞粘着连接完整性、降低血管渗漏程度。<br>　　接下来，出于胞外基质成分和血管渗透性对MDSC趋化迁移的影响，本研究进一步考察了多肽FR17对于转移前微环境中MDSC募集的影响。研究表明，多肽FR17有效抑制了肺转移前微环境模型肺组织中MDSC的募集；由转移前微环境刺激响应释放的TP5及触发组装形成的“多肽纳米毯”分别作用于不同细胞通路，阻止了免疫抑制性微环境的形成。胞外基质成分和MDSC细胞共定位结果证实“多肽纳米毯”通过抑制成纤维细胞激活调控胞外基质，减少了MDSC的趋化募集。此外，肺组织中募集的PMN-MDSC的转录组分析表明，响应性后组装多肽FR17主要影响了免疫系统激活、免疫细胞趋化迁移、免疫细胞促分化、免疫细胞功能调控等相关通路。其中，对免疫细胞趋化迁移的影响主要与定点组装形成的“多肽纳米毯”有关，而对免疫细胞分化和T细胞激活的调控则主要与TP5有关。<br>　　综上，本研究基于对肺转移前微环境动态病理进程和分子生物学特征的考察，设计构建了转移前微环境响应性后组装多肽FR17。该多肽分子能够在转移前微环境中响应性后组装形成纳米载体——“多肽纳米毯”，实现良好的肿瘤转移防治效果，并在抑制恶性肿瘤术后复发和转移的应用中表现出一定潜力。机制研究沿着TDSF——转移前微环境相关成纤维细胞——血管内皮细胞——MDSC这条细胞作用通路，揭示了响应性后组装形成的“多肽纳米毯”通过抑制转移前微环境中成纤维细胞的激活，遏止了基质重塑、血管新生和渗漏过程；抑制MDSC迁移趋化，降低了MDSC募集比例，改善了免疫抑制性微环境，从而通过抑制转移前微环境的形成抑制了转移的发生。本研究揭示了转移前微环境相关成纤维细胞的关键调控作用，为针对转移前微环境的靶向干预提供了重要靶点；发现了后组装形成的“多肽纳米毯”具有微环境调控作用，为抗肿瘤转移药物的体内递送提供了一种自身具有微环境调控能力的响应性后组装的功能性载体平台。