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摘要缓激肽受体（bradykinin receptors）属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）家族成员，是激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）的重要组成部分。缓激肽受体包含B1R和B2R两个亚型，天然配体为血液中的激肽类物质，比如缓激肽（bradykinin）和kallidin等。B2R在人体各组织中均有表达，B2R被激活后主要介导下游Gαq蛋白信号通路，引发磷脂酶C（phospholipase C，PLC）的激活及钙动员过程。在生理状态下，B2R参与调节人体血液循环和肾脏功能，引发炎症反应和疼痛。而在病理状态下，B2R功能异常将引起心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）、肾脏疾病、呼吸道疾病、癌症和遗传性血管水肿（hereditary angioedema，HAE）等。B2R作为药物靶点，在炎症、心血管疾病、神经痛等领域具有十分广阔的应用前景。虽然有不少靶向B2R的配体进入了临床研究，但至今只有一个肽类药物艾替班特（icatibant）成功上市，用于治疗遗传性血管水肿。其他配体比如用于治疗脑肿瘤的肽类激动剂Labradimil、治疗疼痛的肽类拮抗剂Deltibant和治疗骨关节炎的小分子拮抗剂Fasitibant等均在Ⅱ期和Ⅲ期临床试验阶段宣告失败。靶向B2R的药物研发进展缓慢，一是因为传统药物筛选方法成本高、耗时长、效率低，二是在缺乏B2R结构数据的情况下不能确定参与配体结合和受体激活的关键位点。因此，亟需B2R跨膜信号复合物的结构数据以及高通量筛选技术来助力靶向B2R的新型药物研发工作，用于心血管疾病、炎症及神经痛的治疗。<br>　　本课题的研究目标是应用结构生物学的方法解析药物靶点B2R跨膜信号复合物的结构，揭示激动剂结合——B2R激活——Gq蛋白偶联的分子机制，加快基于结构的新型药物研发进程。通过对B2R进行N/C末端截短筛选、融合蛋白类型及融合位点筛选、定点突变筛选，成功得到了高表达量、高纯度、均一性良好的单体蛋白。通过热稳定性测试发现拮抗剂icatibant与B2R所形成复合物的热稳定性最高，并用于脂立方相（lipidic cubic phase，LCP）结晶实验。同时又对B2R-Gq蛋白复合物进行研究，为了获得稳定的复合物样品，B2R和Gαq蛋白均进行了改造。在缓冲液组分优化过程中，发现相较于DDM/CHS去垢剂组合，LMNG/CHS能更好地将B2R从细胞膜中提取到胶束（micelle）中，且在冷冻制样阶段能帮助复合物保持稳定、不易解离。在300kV冷冻电镜下收集数据后，成功解析出了3.0?分辨率的B2R-Gq-bradykinin和2.9?分辨率的B2R-Gq-kallidin复合物结构。<br>　　经过对复合物结构进行分析，发现在配体结合口袋中，激动剂呈现“S”形的结合构象，口袋入口处存在大量Asp和Glu，通过与激动剂末端的Arg和Lys形成静电相互作用来阻止激动剂的解离。此外，P3B/P4K-I213ECL2和G4B/G5K-R1964.64两对氢键将激动剂稳稳地锚定在配体口袋内，提高了两者间的亲和力。激动剂C末端的Phe诱发toggle switch、PIF、DRY和NPxxY等分子开关的构象变化，导致TM6胞内侧外移及Gq蛋白结合。Gq蛋白通过与B2R的TMs2-3、TMs5-7、ICLs2-3和helix8形成大量的氢键、极性相互作用、静电相互作用和疏水相互作用而稳定复合物的结构。<br>　　通过解析B2R跨膜信号复合物的结构，揭示了药物靶点B2R在激动剂结合、受体激活和Gq蛋白偶联时的分子机制，结合基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD）方法，将为靶向B2R的新型药物研发提供帮助。