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摘要目的：人体感染日本血吸虫后形成以肝纤维化为主要特征的病理损伤，其中肝星状细胞是主要的效应细胞。自然杀伤成员2D受体（Natural killer group2member D Receptor，NKG2D）作为强有力的刺激性受体，能够激活自然杀伤细胞（Natural killer cells，NK）产生干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）从而杀伤肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs），抑制肝纤维化的进展。小鼠可溶性UL16结合蛋白样转录本1（soluble Murine ULBP-like transcript1，sMULT1）是NKG2D配体的可溶性形式，可以上调NK细胞表面NKG2D受体的表达，增强NK细胞的免疫功能。本研究拟采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建过表达sMULT1的基因修饰小鼠，并以此为基础探讨sMULT1过表达对小鼠血吸虫病肝纤维化的影响。<br>　　方法：一、使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将重组序列CAG-loxp-stop-loxp-sMULT1定点打靶插入小鼠染色体的ROSA26处，得到Loxp-stop-Loxp sMULT1小鼠(技术操作由公司完成)。通过高压尾静脉的方式给Loxp-stop-Loxp sMULT1小鼠注射pcDNA3.1-Cre质粒诱导小鼠过表达sMULT1，对照组小鼠注射等剂量的pcDNA3.1-GFP质粒。质粒注射一个月时视为实验终点，通过双抗夹心微球法检测小鼠血清中sMULT1的蛋白表达水平；Hamp;E组化染色分析小鼠肝脏、脾脏和肾脏的病理改变；流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏中CD4+T、CD8+T和NK细胞的比例以及细胞表面NKG2D和CD69的表达水平；流式细胞微球阵列（Cytometric Bead Array，CBA）法检测小鼠血清中炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12P70、MCP1和TNF的分泌水平。<br>　　二、为了研究sMULT1过表达对小鼠血吸虫病肝纤维化的影响，将B6.129-Albtm1(CreERT2)Smoc小鼠和Loxp-STOP-Loxp sMULT1小鼠交配，筛选鉴定出同时带有Cre-ERT和sMULT1基因的子代小鼠作为实验组小鼠，选择同窝小鼠作为对照。经皮肤感染18±2条尾蚴，在感染第4周末对小鼠腹腔注射他莫昔芬，诱导小鼠肝脏特异性过表达sMULT1，感染第8周视为实验终点。他莫昔芬注射前后记录小鼠体重变化；通过双抗夹心微球法检测他莫昔芬诱导后第9、16、23、27天小鼠血清中sMULT1的蛋白表达水平；Hamp;E组化染色分析小鼠肝脏、脾脏、肾脏和结肠的病理改变；MASSON染色分析小鼠肝脏纤维化程度；实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）、1型胶原蛋白（Collagen1，col1a-1）、转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）、结蛋白（Desmin）的mRNA表达；谷丙转氨酶（ALT/GPT）微板法检测小鼠血清中谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）水平；流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏中CD4+T、CD8+T、NK和NKT细胞的比例变化以及细胞表面NKG2D受体和细胞因子IFN-γ的表达水平；CBA法检测小鼠血清中炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12P70、MCP1和TNF的分泌水平。<br>　　结果：一、双抗夹心微球法结果显示pcDNA3.1-Cre质粒诱导一个月后小鼠sMULT1的表达明显增加，与对照组相比有显著性差异（P=0.0016，n≥5），说明成功构建了sMULT1过表达的转基因小鼠。Hamp;E染色结果显示sMULT1过表达小鼠肝脏和肾脏的组织结构与对照质粒诱导组小鼠相比无明显差别，脾脏中出现较多Reed-Sternberg样细胞。与对照质粒诱导组小鼠相比较，sMULT1过表达小鼠脾脏细胞中CD4+T、CD8+T和NK细胞比例无显著性差异（P＞0.05，n≥5），肝脏细胞中CD8+T和NK细胞比例无显著性差异（P＞0.05，n≥5），但CD4+T细胞所占比例有所下降（P=0.0391，n≥5）；sMULT1过表达小鼠脾脏和肝脏CD4+T、CD8+T和NK细胞表面活化型受体NKG2D和CD69的表达相较于对照组均无明显差别（P＞0.05，n≥5）。sMULT1过表达小鼠血清中IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-12P70和TNF炎性细胞因子的表达与对照质粒诱导组小鼠相比均无明显变化（P＞0.05，n≥5）。<br>　　二、在研究sMULT1过表达对小鼠血吸虫病肝纤维化的影响的实验中，双抗夹心微球法结果显示他莫昔芬诱导后第23和27天Alb-Cre+/sMULT1CKI+小鼠血清中sMULT1浓度与对照组小鼠相比有显著性差异（P值分别为0.0079和0.0077，n≥3）。肝脏虫卵计数结果显示，血吸虫感染的sMULT1过表达组小鼠与对照组小鼠感染程度无差异（P＞0.05,n≥3）。Hamp;E和MASSON染色结果显示，血吸虫感染后，与对照组小鼠相比，sMULT1过表达小鼠肝脏单个虫卵肉芽肿面积和胶原沉积面积均减小，脾脏仍可见较多Reed-Sternberg样细胞，同时观察到肾皮质有少许淋巴细胞增生，结肠无明显变化；实时定量荧光PCR结果显示sMULT1过表达小鼠肝组织中α-SMA、TGF-β、CTGF、Desmin的表达显著降低（P值分别为0.0441、0.0002、0.0041和0.0066，n≥3）；谷丙转氨酶（ALT/GPT）微板法结果显示sMULT1过表达小鼠血清ALT分泌减少（P=0.0313，n≥3）。流式细胞术结果显示，血吸虫感染后，与对照组小鼠相比，sMULT1过表达组小鼠肝脏和脾脏CD4+T、CD8+T、NK和NKT细胞比例均无明显差异（P＞0.05，n≥3），而脾脏中NK和NKT细胞表面NKG2D表达水平显著增高（P值分别为＜0.0001和0.0024，n≥3），肝脏中NK和NKT细胞表面NKG2D表达水平也显著增高（P值分别为0.0070和0.0005，n≥3）；脾脏和肝脏NKG2D+NK1.1+细胞所占比例均高于对照组小鼠（P值分别为0.0249和0.0327，n≥3）；sMULT1过表达组小鼠肝脏和脾脏中CD4+T、CD8+T、NK和NKT细胞IFN-γ的分泌与对照组相比无显著性差异（P＞0.05，n≥3）。检测炎性细胞因子发现，与对照组小鼠相比，sMULT1过表达组小鼠血清中IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12P70、MCP1和TNF的分泌均无明显变化（P＞0.05，n≥3）。<br>　　结论：本研究通过观察sMULT1过表达基因修饰小鼠的表型发现，生理状态下，过表达sMULT1在多个器官组织均没有造成炎性病变，也没有观察到NKG2D阳性的免疫细胞因此被活化，说明项目所构建的sMULT1过表达小鼠可用于血吸虫病相关的免疫学机制研究。进一步，本研究利用sMULT1过表达小鼠，在血吸虫病模型小鼠体内诱导sMULT1过表达，观察到多项肝纤维化指标的下调，同时观察到NK、NKT细胞表面NKG2D的上调，说明sMULT1过表达可抑制血吸虫病小鼠肝纤维化，其免疫学机制与MULT1的受体NKG2D水平上调有关。