检索历史 清除

摘要Tau蛋白是一种神经系统内含量最高的微管相关蛋白，主要功能是促进微管蛋白聚集成微管，并维持其稳定。已有研究发现，阿尔茨海默病（Alzheimer''s disease,AD）患者脑组织、脑脊液及血浆中tau蛋白水平增加。Tau蛋白水平增加能够促使神经原纤维缠结（Neurofibrillarytangles,NFTs）的形成，这是AD患者脑内特征性病理变化之一。另外，细胞内tau蛋白水平增多也能独立于NFTs的形成而影响神经元的信号转导、突触可塑性和基因组稳定性。溶酶体是神经元内清除过量tau蛋白的“主力军”，并且健康的溶酶体对于维持神经元的信息传递和代谢活动非常重要。已有研究报道AD患者海马神经元中存在异常结构的溶酶体——颗粒泡状变性小体（Granulovacuolar degeneration bodies,GVBs）。另外，在AD模型中溶酶体存在酸化受阻，水解能力障碍，钙离子失衡的功能改变。但是目前tau蛋白过表达对溶酶体的形态与功能的具体影响还不清楚。<br>　　目的：<br>　　1.人野生型全长tau（Wild-type full-length human tau,Wt-htau）过表达对溶酶体形态及功能的影响。<br>　　2.人P301S突变型tau（P301S mutant human tau,P301S-htau）过表达对溶酶体形态的影响。<br>　　方法：<br>　　培养稳定过表达wt-htau的HEK293细胞株（293MAPT）和其对照细胞株（293Vec），利用蛋白质组学技术，检测两种细胞的差异蛋白，并通过基因本论（Gene Ontology,GO）从分子功能、生物过程与KEGG通路进行通用分析，用STRING数据库进行互作网络分析。进一步，运用多重荧光标记结合共聚焦与超高分辨技术，比较293Vec与293MAPT两组细胞株中溶酶体的形态差异。此外，在N2a细胞中瞬时过表达wt-htau，运用上述方法观察溶酶体形态变化。在此基础上，进一步研究了293MAPT细胞中溶酶体损伤、生物发生、酸度、V-ATP酶及蛋白水解酶的变化。<br>　　运用上述研究技术及透射电镜技术，观察P301S-htau过表达的细胞和P301S小鼠海马区中溶酶体受损情况及形态的变化。<br>　　结果：<br>　　1.在293Vec、293MAPT蛋白质组学分析中，共鉴定到5770个蛋白质，其中5045个有定量信息。以293MAPT组相比293Vec组变化倍数大于1.2倍为上调，小于0.83（1/1.2）为下调为标准，筛选出1432个差异蛋白（743个上调，689个下调），功能富集提示多种差异蛋白与溶酶体相关度高，主要涉及溶酶体膜、酶、质子泵、脂质转运等。<br>　　2.Wt-htau过表达对溶酶体的形态的影响：二维成像显示293MAPT细胞内溶酶体个数减少、平均面积变大、平均总面积不变；三维成像进一步显示溶酶体平均总表面积不变、平均总体积变大，平均相对表面积（表面积/体积）减小。N2a细胞中瞬时过表达wt-htau，溶酶体形态变化与293MAPT细胞一致。<br>　　3.Wt-htau过表达对溶酶体的功能的影响：酸度降低、膜损伤、生物发生增强、V-ATP酶及蛋白水解酶增加。<br>　　4.P301S-htau过表达对溶酶体形态的影响：三维成像显示HEK293及N2a细胞内溶酶体个数减少、平均体积变大，与wt-htau过表达无差异。<br>　　5.9月龄P301S小鼠的脑内溶酶体存在损伤，海马神经元内溶酶体聚集增多、面积变大，腔内蓄积线粒体、脂滴等明显增多。<br>　　结论：<br>　　1.Wt-htau水平增加导致溶酶体体积变大，同时导致溶酶体膜受损、生物发生增加、V-ATP酶及蛋白水解酶增加、酸度降低。<br>　　2.P301S-htau水平增加导致的溶酶体体积变大。P301S小鼠脑内溶酶体损伤，海马神经元内溶酶体聚集增多、面积变大，腔内蓄积线粒体、脂滴等明显增多。