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摘要目的：镉是一种广泛存在的环境化学污染物，是诱发肺癌的致癌物之一。镉的致突变性较弱，因此表观遗传调控成为镉致癌机制的主要研究方向之一。环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来被发现具有调控作用的表观遗传分子之一，其在癌症机制中发挥重要作用，但circRNA在镉致癌中的作用尚不清楚。circRNA作为miRNA分子海绵发挥竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制是circRNA中研究最多的机制。随着研究的深入，越来越多的circRNA被发现可通过直接与蛋白相互作用，发挥调节作用。在环境化学致癌的研究中，已经发现circRNA通过ceRNA机制参与调节化学物致癌。但尚未有circRNA与蛋白直接作用调控化学物致癌的研究报道。体外细胞转化是一种用细胞培养的方式研究致癌物作用机制的研究模型，常用于化学物致癌的研究中。因此本研究以镉诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞转化为模型，旨在研究circRNA对镉所致转化人支气管上皮细胞恶性表型的作用及circRNA通过直接作用于蛋白调控镉转化细胞恶性表型的机制。<br>　　方法：使用2.0μM氯化镉连续染毒BEAS-2B细胞20周，软琼脂克隆形成实验检测细胞的非锚定依赖性生长能力；细胞转化后，提取同代对照BEAS-2B细胞（control-BEAS-2B,C-BEAS-2B）和镉诱导转化BEAS-2B细胞（transformed-BEAS-2B,T-BEAS-2B）的RNA，Nanodrop分光光度计、安捷伦2100分析仪和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量；Illumina HiSeq Xten平台进行高通量测序检测分析；实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）验证上调和下调倍数最多的circRNA各5条；RNase R酶和oligo(dT)引物验证circSPAG16的环状特性；核质分离实验检测BEAS-2B细胞中circSPAG16的亚细胞定位；放线菌素D实验检测BEAS-2B细胞中circSPAG16的稳定性；qRT-PCR检测circSPAG16线性异构体在C-BEAS-2B和T-BEAS-2B中的表达变化、circSPAG16在镉诱导细胞转化过程中的表达变化以及circSPAG16在肺癌细胞系与正常BEAS-2B细胞相比的表达变化；慢病毒感染和siRNA转染分别对T-BEAS-2B细胞的circSPAG16过表达和敲低，检测circSPAG16对细胞恶性表型的影响，包括增殖、迁移、侵袭和非锚定依赖性生长能力；构建稳定过表达circSPAG16的BEAS-2B稳转细胞系，2.0μM氯化镉连续染毒20周后，检测细胞恶性表型；RNA pulldown、蛋白定性质谱和RNA免疫共沉淀实验确认与circSPAG16结合的蛋白——磷酸肌醇4-磷酸5-激酶α（phosphatidylinositol4-phosphate5-kinasesα，PIP5K1α）；用PIP5K1α特异性抑制剂ISA-2011B抑制T-BEAS-2B细胞中PIP5K1α的功能，研究PIP5K1α对镉所致转化人支气管上皮细胞恶性表型的作用；在T-BEAS-2B中过表达circSPAG16，研究circSPAG16对PIP5K1α及其下游分子磷脂酰肌醇二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2]和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphorylated Akt，pAkt）的影响；在T-BEAS-2B中共表达circSPAG16和PIP5K1α，研究回复PIP5K1α表达对细胞恶性表型的影响；平板克隆形成实验、细胞划痕实验、transwell侵袭实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞的恶性表型；免疫荧光和Western blot分别检测PIP5K1α下游分子PIP2和pAkt表达水平。<br>　　结果：实验结果分三部分。<br>　　第一部分：1.高通量测序检出9857条circRNA，其中222条表达上调超过1.5倍（P＜0.05），256条表达下调超过1.5倍（P＜0.05）。2.qRT-PCR验证上调和下调倍数最多的circRNA各5条，其中4条circRNA的表达变化与测序结果相同且具有显著性（P＜0.05）。3.hsa_circ_0058040（来源于基因SPAG16，后续记为circSPAG16）为T-BEAS-2B细胞中下调最多的circRNA，表达量约为C-BEAS-2B的五分之一（P＜0.01）。<br>　　第二部分：1.circSPAG16具有较高的RNase R抗性（P＜0.01），无poly(A)尾，主要定位于细胞质中，与线性RNA相比具有更高的稳定性（P＜0.05）。2.SPAG16mRNA在C-BEAS-2B和T-BEAS-2B中无显著变化。3.随着染毒周数的增加，circSPAG16的表达逐渐下调，并自第8周起具有显著性差异（P＜0.05）。4.与正常人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞相比，circSPAG16在肺癌细胞系A549、H1299和H460中的表达显著性下调（P＜0.05）。5.过表达circSPAG16使T-BEAS-2B细胞的恶性表型受到显著抑制（P＜0.01）；与之相反，敲低circSPAG16使T-BEAS-2B细胞的恶性表型显著性增强（P＜0.05）。6.过表达circSPAG16显著性抑制镉所致BEAS-2B细胞转化（P＜0.01）。<br>　　第三部分：1.circSPAG16与磷脂激酶PIP5K1α直接结合。2.抑制T-BEAS-2B细胞中PIP5K1α的功能使PIP2表达减少、pAkt表达显著性下降（P＜0.01），细胞的恶性表型显著性减弱（P＜0.01）。3.T-BEAS-2B细胞中过表达circSPAG16使PIP2表达减少、pAkt表达显著性下降（P＜0.05）。4.同时过表达circSPAG16和PIP5K1α，与单独过表达circSPAG16组相比，被circSPAG16抑制的PIP2、pAkt表达水平上调，细胞的恶性表型显著性增强（P＜0.01）。<br>　　结论：circSPAG16在镉诱导转化的人支气管上皮细胞中下调倍数最多。circSPAG16抑制镉所致人支气管上皮细胞转化。circSPAG16通过结合并抑制PIP5K1α，使PIP2、pAkt表达水平下降，从而抑制镉所致人支气管上皮细胞转化。