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摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分:Aβ1-40通过上调周细胞CD36的表达导致血脑屏障破坏<br>　　目的：<br>　　周细胞是神经血管单位和血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的重要组成部分，充当BBB的守门人，过量的Aβ在大脑中的生成和沉积进一步导致周细胞死亡，诱导血脑屏障破坏。CD36是参与Aβ转运的一种多功能糖蛋白，敲除CD36的表达能抵消APP/PS1小鼠导致的脑血管功能障碍，并且能增加周细胞的数量还可以诱导周细胞形态部分正常化。但其中的分子机制和在周细胞及血脑屏障破坏中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨Aβ1–40经周细胞CD36对血脑屏障破坏的影响及意义，并进一步探讨及具体的信号转导机制。<br>　　方法：<br>　　动物水平，实验组为6月和9月APP/PS1双转基因小鼠，对照组为相同品系，年龄、性别匹配的野生型（Wild Type，WT）小鼠。通过PET/CT测血脑屏障，免疫组化法染Aβ斑，免疫荧光染PDGFRβ（周细胞）、CD36、GLUT1（内皮细胞）、Aβ，western blot检测CD36、LRP1、NG2、PDGFRβ蛋白水平的变化。<br>　　细胞水平：通过提取原代周细胞后与内皮细胞bEnd.3细胞系共培养，建立Transwell体外接触型血脑屏障模型。通过跨内皮阻抗（Trans-endotheilal electrical resistance，TEER）测定共培养模型的验证BBB的紧密连接性，通过荧光酶标仪测量FITC-葡聚糖和FITC-Aβ1-40的渗透量测血脑屏障通透性。并通过带红色荧光的Hylite FluorTM555-Aβ1-40与周细胞共孵育1小时，免疫荧光观察周细胞吞噬Aβ1-40并与CD36共定位。慢病毒转染的方法敲低CD36的表达，并在蛋白水平和转录水平检测抑制效率。测Aβ1-40对周细胞血脑屏障影响时，对建立好的血脑屏障，在Transwell下室加Aβ1-40100nM和1uM6小时后再检测TEER和通透性。实验分组：(1)对照组（CTR组）：细胞正常培养换液。(2)DMSO组：细胞在体外血脑屏障模型6天后，在Transwell的下室加入与Aβ1-40等浓度的DMSO作为溶剂对照组。(3)Aβ1-40组：分别在Transwell的下室加入Aβ1-40100nM和1uM两个剂量组，处理6小时后进行后续试验。(4)si-CD36组：用RNA干扰技术下调周细胞CD36，然后再建立体外血脑屏障模型，处理方式同Aβ1-40组，用来验证CD36在周细胞血脑屏障中的作用。(5)si-NC组：作为si-CD36的阴性对照，转空载体对照后建立体外血脑屏障，后续实验同si-CD36组。Western blot和RT-qPCR观察CD36和LRP1表达改变情况。<br>　　结果：<br>　　1)APP/PS16月和9月小鼠血脑屏障受损，且周细胞减少，CD36表达降低；<br>　　2)APP/PS16月小鼠Aβ斑形成，且周细胞表达CD36并与Aβ共定位；<br>　　3)周细胞经CD36吞噬Aβ1-40，周细胞经Aβ1-40处理后高表达CD36；<br>　　4)Aβ1-40增加BBB的通透性，下调周细胞CD36的表达后改善了BBB的通透性。<br>　　结论：<br>　　周细胞（PDGFRβ）、CD36、β淀粉样蛋白存在共定位，且Aβ1-40通过上调周细胞CD36的表达水平导致BBB破坏，siCD36后BBB紧密型增高，渗透性降低。<br>　　第二部分:Aβ1-40通过CD36/PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬并诱导周细胞铁死亡<br>　　目的：<br>　　Aβ1-40被周细胞经CD36吞噬到细胞内后，在细胞内降解，探讨Aβ1-40对周细胞的影响，同时检测通路蛋白的改变，探究其发挥作用的信号转导机制。并进一步并探讨CD36分子在Aβ1-40对周细胞损伤中发挥的作用及意义。<br>　　方法：<br>　　本实验以原代脑微周细胞为主要研究对象。分别用Aβ1-40100nM和1uM对体外培养的周细胞进行刺激，用CCK-8观察其对增值的影响。并通过流式细胞技术观察线粒体活性氧和线粒体膜电位的改变。用自噬激动剂CCCP，自噬抑制剂CQ和Mdivi-1进行验证其对线粒体自噬的影响。铁死亡方面的探讨，用铁死亡激动剂Erastin和抑制剂FER-1进行验证。CD36的敲减采用慢病毒转染的技术，并以空载体做对照。实验分组：1).CTR组2).DMSO组3).Aβ1-40（100nM或1uM）组4).CCCP组5).CQ组6).CQ+Aβ1-401uM组7).Mdivi-1组8).Mdivi-1+Aβ1-401uM组9).Erastin组10).FER-1组11).FER-1+Aβ1-401uM组12).si-NC组13).siCD36组14).si-NC+Aβ1-401uM组15).siCD36+Aβ1-401uM组。通过免疫荧光染线粒体基质蛋白HSP60和自噬体蛋白LC3，及溶酶体示踪剂观察自噬流改变，通过电镜观察线粒体自噬体和线粒体损伤改变，流式细胞仪法观察凋亡率，用试剂盒测ATP、GSH-PX、铁离子水平改变，通过荧光酶标仪测脂质活性氧和Fe2+水平。荧光探针DHE和ROS测活性氧水平改变。Western blot检测CD36、HSP60、Tim23、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BCL2、BAX、caspase3（P35）和cleaved-caspase3（P17）、GPX4、xCT、Ferritin、NOX1、S65、BNIP3、NIX、PINK1和Parkin等蛋白水平的变化。RT-qPCR检测HSP60、Tim23在转录水平的改变。<br>　　结果：<br>　　1)Aβ1-40抑制周细胞增值，导致线粒体损伤，并诱导线粒体自噬增加；<br>　　2)小剂量Aβ1-40处理周细胞6h后未导致细胞凋亡，但周细胞氧化应激增加；<br>　　3)Aβ1-40导致周细胞线粒体自噬依赖的铁死亡；<br>　　4)Aβ1-40通过CD36/PINK1/Parkin通路诱导周细胞线粒体自噬。<br>　　结论：<br>　　Aβ1-40通过CD36/PINK1/Parkin通路诱导周细胞线粒体自噬依赖的铁死亡。