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摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分 不同剂量PDX对急性肺损伤的影响<br>　　目的：在脓毒症小鼠中，使用不同剂量的保护素DX(Protectin DX，PDX)，观察其对小鼠急性肺损伤的影响。<br>　　方法：动物实验的实施采用雄性6-8周的C57小鼠，选取28只，将其随机平均分为4组：(1)假手术组(Sham)：小鼠假手术，用剪刀切开小鼠腹腔，缝合各层，1h后，取100μlPBS，腹腔注射小鼠体内；(2)脓毒症(CLP)组：用小鼠建立CLP脓毒症动物模型，1h后，取100μlPBS，腹腔注射小鼠体内；(3)CLP+LD-PDX组：行CLP术，1h后,将500ng PDX溶解于100μlPBS中，腹腔注射到小鼠体内；(4)CLP+HD-PDX组:行CLP术，1h后，将1000ng PDX溶解于100μlPBS中，腹腔注射到小鼠体内。24h后抽取动脉血行血气检测。收集肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF），收集结扎的小鼠右肺组织。我们采用HE染色的方法，在光镜下观察肺组织病理学改变，进行肺损伤评分，称重并计算肺组织湿干重比。使用BCA检测BALF中蛋白浓度，使用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定BALF中炎症因子白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、和巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)的浓度。<br>　　结果：CLP组与Sham组相比，氧合指数显著降低，肺组织可见明显病理损伤，且肺病理损伤评分、湿干重比及BALF中蛋白浓度明显增高，显著上调了IL-1β、IL-6、TNF-α、和MIP-2炎性因子的表达；PDX的使用明显提高了氧合指数，减轻了肺组织病理学改变，降低了肺损伤评分、湿干重比及BALF中的蛋白浓度，显著下调炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、和MIP-2的表达；与CLP+LD-PDX组相比，CLP+HD-PDX组的氧合指数更高，肺组织病理损伤得到更为有效的改善，肺损伤评分、干湿重比及BALF蛋白浓度及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、和MIP-2的表达更低。<br>　　结论：PDX能改善氧合指数，减轻肺组织病理损伤，降低肺损伤评分、湿干重比及BALF中蛋白浓度，下调IL-1β、IL-6、TNF-α、和MIP-2炎性因子的表达，从而实现对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用，且大剂量PDX比小剂量PDX效果更好。<br>　　第二部分 PDX通过调节中性粒细胞凋亡保护脓毒症致急性肺损伤<br>　　目的：建立CLP致小鼠脓毒症肺损伤模型及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激体外中性粒细胞模型，观察PDX对中性粒细胞凋亡的调节作用。<br>　　方法：动物模型：28只雄性6-8周C57小鼠随机分为4组,每组各7只小鼠：(1)假手术组(Sham)：小鼠假手术，用剪刀切开小鼠腹腔，缝合各层，1h后，取100μlPBS，腹腔注射小鼠体内；(2)脓毒症(CLP)组：用小鼠建立CLP脓毒症动物模型，1h后，取100μlPBS，腹腔注射小鼠体内；(3)CLP+LD-PDX组：行CLP术，1h后,将500ng PDX溶解于100μlPBS中，腹腔注射到小鼠体内；(4)CLP+HD-PDX组:行CLP术，1h后，将1000ng PDX溶解于100μlPBS中，腹腔注射到小鼠体内。24h后，收集BALF并进行白细胞分类计数，采用流式细胞术检测中性粒细胞凋亡情况。体外细胞实验：首先，采集健康成年志愿者的外周血，将中性粒细胞按照1×106/ml密度接种于培养板上，依据使用的PDX浓度不同将细胞分为4组：①对照组：用0.038%PB培养基培养；②PDX小剂量组：用PDX终浓度10nM培养基培养；③PDX中剂量组：用PDX终浓度100nM培养基培养；④PDX大剂量组：用PDX终浓度为1000nM培养基培养。不同的组别至少设置3个复孔。细胞经PDX处理24h后进行MTT实验检测PDX毒性。其次，将中性粒细胞按照1×106/ml密度接种于培养板上，根据药物不同将细胞分为5组：①对照组：用加入PDX溶剂即0.038%PBS的培养基培养中性粒细胞；②LPS组：用1μg/ml LPS的培养基处理；③LPS+PDX10nM组：1μg/ml LPS培养基处理1h，加入PDX使终浓度10nM；④LPS+PDX100nM组：1μg/mlLPS培养基处理1h，加入PDX使终浓度100nM；?LPS+PDX1000nM组：1μg/mlLPS培养基处理1h，加入PDX使终浓度1000nM。不同的组别至少设置3个复孔。中性粒细胞经24h培养后进行流式细胞术检测其凋亡情况，以2，7-二氯氢化荧光素二酯（2,7-Dichlorodi-hydrofluoresceindiacetate，DCFH-DA）作为探针，检测细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达水平，采用ELISA检测细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2的水平。<br>　　结果：在动物模型中，与Sham组相比，CLP组BALF中总细胞数、中性粒细胞及单核/巨噬细胞数明显增多，且应用流式细胞术检测发现中性粒细胞凋亡显著减少；与CLP组相比，PDX的使用明显减少了总细胞数及中性粒细胞数，且流式细胞术检测提示显著促进了中性粒细胞的凋亡；与CLP+LD-PDX组相比，CLP+HD-PDX组的总细胞数及中性粒细胞数减少更多，且流式结果显示中性粒细胞凋亡的更多。细胞试验中，不同剂量的PDX对中性粒细胞无毒性作用；LPS显著降低中性粒细胞凋亡;与LPS组比较，LPS+PDX100nM组和LPS+PDX1000nM组能显著促进中性粒细胞凋亡，而LPS+PDX10nM的这一作用不明显；与LPS+PDX10nM组相比，LPS+PDX100nM组和LPS+PDX1000nM组促进中性粒细胞凋亡的作用更显著；与LPS+PDX100nM组，PDX1000nM组能更有效地促进中性粒细胞凋亡。因此，我们后面的细胞实验中,不再加入LPS+PDX10nM组。与Control组相比，LPS组ROS产生显著增加，刺激中性粒细胞生成大量IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2；LPS+PDX100nM组和LPS+PDX1000nM明显减少LPS诱导的ROS产生，显著降低细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2）的浓度；与LPS+PDX100nM组相比，LPS+PDX1000nM组产生的ROS明显减少，L-1β、IL-6、TNF-α的水平明显降低。<br>　　结论：PDX通过促进中性粒细胞凋亡发挥对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用。<br>　　第三部分 PDX通过PI3K-AKT及MAPK-ERK信号通路调节中性粒细胞凋亡<br>　　目的：探讨PDX调节中性粒细胞凋亡的可能分?机制。<br>　　方法：采集健康成年志愿者的外周血，将中性粒细胞按照1×106/ml密度接种于培养板上，根据药物不同将细胞分为4组：①对照组：用加入PDX溶剂即0.038%PBS的培养基培养；②LPS组：1μg/ml LPS培养基处理；③LPS+PDX100nM组：1μg/mlLPS培养基处理1h，加入PDX使终浓度100nM；④LPS+PDX1000nM组：1μg/ml LPS培养基处理1h，加入PDX使终浓度1000nM。不同的组别至少设置3个复孔。24h后分离出细胞，western blot检测p-AKT、p-ERK、p-p38、Bcl-2、Bax的表达。<br>　　结果：LPS明显上调了中性粒细胞中p-AKT、p-ERK、p-p38、Bcl-2的表达，下调了Bax的表达；与LPS组相比，PDX100nM组和PDX1000nM显著降低了p-AKT、p-ERK、p-p38、Bcl-2的表达，显著上调了Bax的表达；与LPS+PDX100nM组相比，1000nMPDX明显降低中性粒细胞中p-ERK、p-p38的表达，上调了Bax的表达。<br>　　结论：PDX促进脓毒症模型中性粒细胞凋亡作用是通过下调Bcl-2的表达，上调Bax的表达来实现的，其机制可能是PI3K/AKT及P38/ERK信号通路介导的。