LRIG3通过PI3K/AKT信号通路调节VEGFA介导的胶质瘤血管生成-论文-万方医学网

LRIG3通过PI3K/AKT信号通路调节VEGFA介导的胶质瘤血管生成

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摘要本文主要从以下几方面进行论述： 　　第一部分过表达LRIG3蛋白的胶质瘤细胞对血管内皮细胞生物学功能的影响的体外研究 　　目的：探讨胶质瘤细胞在过表达LRIG3蛋白后，对血管内皮细胞迁移、微管结构形成、增殖能力的影响。 　　方法：利用U87、U251胶质瘤细胞系，建立LRIG3蛋白稳定过表达组及空载体对照组。各组胶质瘤细胞LRIG3蛋白的过表达效率用Western blot进行验证。收集胶质瘤细胞培养基上清、制备相应的条件培养基。LRIG3蛋白过表达组和对照组的条件培养基分别作用于脐静脉内皮细胞，采用划痕愈合实验、Transwell小室迁移实验、MTT增殖实验、微管形成实验，分别检测不同条件培养基对脐静脉内皮细胞的迁移、增殖、微管结构形成能力的影响，分析胶质瘤细胞过表达LRIG3蛋白后，对血管内皮细胞生物学功能的影响。 　　结果：LRIG3蛋白过表达组条件培养基，相对于对照组，使脐静脉内皮细胞的迁移、增殖、微管结构形成能力下降，差异均有统计学意义，p＜0.05。 　　结论：在体外研究中，胶质瘤细胞过表达LRIG3蛋白，具有抑制肿瘤细胞诱导血管生成的能力。 　　第二部分胶质瘤细胞LRIG3蛋白表达下调对血管内皮细胞生物学功能的影响的体外研究 　　目的：探讨胶质瘤细胞在LRIG3蛋白表达下调后，对血管内皮细胞迁移、微管结构形成、增殖能力的影响。 　　方法：利用U87、U251胶质瘤细胞系，建立LRIG3蛋白表达敲低组及对照组。各组胶质瘤细胞LRIG3蛋白表达下调效率采用Western blot进行验证。收集各组培养基上清、制备条件培养基。LRIG3蛋白表达敲低组和对照组的条件培养基分别作用于脐静脉内皮细胞，采用划痕愈合实验、Transwell小室迁移实验、MTT增殖实验、微管形成实验，分别检测不同条件培养基对脐静脉内皮细胞的迁移、增殖、微管结构形成能力的影响。比较LRIG3蛋白敲低组和对照组条件培养基的作用差异，分析胶质瘤细胞在LRIG3蛋白表达下调后，对血管内皮细胞生物学功能的影响。 　　结果：LRIG3蛋白表达敲低组条件培养基，相对于对照组，使脐静脉内皮细胞的迁移、增殖、微管结构形成能力增强，组间差异均有统计学意义，p＜0.05。 　　结论：在体外研究中，胶质瘤细胞LRIG3蛋白表达下调，增强了肿瘤细胞诱导血管生成的能力。 　　第三部分胶质瘤细胞LRIG3蛋白表达水平对血管生成影响的在体实验研究 　　目的：通过体内实验探讨胶质瘤细胞LRIG3蛋白表达水平对血管生成的影响。 　　方法：利用已经构建的U87、U251细胞系的LRIG3蛋白过表达组、LRIG3蛋白敲低组和各自相应的对照组，建立BALB/c nu裸鼠皮内瘤模型、比较皮内瘤周围直接参与肿瘤供血的毛细血管数目，明确胶质瘤细胞在不同LRIG3蛋白表达水平下，对血管生成诱导能力的差异。利用LRIG3蛋白过表达的U87细胞系及相应对照组，构建裸鼠颅内原位肿瘤模型，磁共振检测颅内肿瘤生长情况，利用PET-CT检测各组对13N-NH3·H2O的标准摄取值，评估LRIG3蛋白不同的表达水平对颅内原位肿瘤血流情况的影响。原位肿瘤进行免疫组化染色，分析肿瘤内微血管密度差异，进一步明确LRIG3蛋白对胶质瘤血管生成的影响。 　　结果：在裸鼠皮内瘤实验中，与各自对照组相比，LRIG3蛋白敲低组的皮内瘤能诱导周围更多的微血管生成参与供血，而LRIG3蛋白过表达组的皮内瘤所诱导的瘤周微血管生成数目显著减少，各组间差异均有统计学意义，p＜0.05。在裸鼠颅内原位肿瘤模型中，LRIG3蛋白过表达组的肿瘤对13N-NH3·H2O的摄取、肿瘤内微血管密度均显著减少，差异有统计学意义，p＜0.05。 　　结论：在体实验研究中，胶质瘤细胞过表达LRIG3蛋白能够抑制胶质瘤血管生成。 　　第四部分 LRIG3蛋白影响胶质瘤血管生成的机制 　　目的：探讨LRIG3蛋白影响胶质瘤血管生成的下游信号因子 　　方法：利用构建的U87、U251细胞系的LRIG3蛋白过表达组、LRIG3蛋白表达敲低组和各自相应的对照组，通过qRT-PCR检测胶质瘤细胞中与血管生成密切相关的多种细胞因子（Ang1、Ang2、FGF、HGF、VEGFA、PDGFB等）的mRNA表达水平，Western Blot进一步验证相应蛋白表达水平变化，ELISA检测各组的条件培养基中相应因子的分泌水平，分析LRIG3蛋白影响胶质瘤血管生成的下游信号因子。 　　结果：在U87、U251细胞系的LRIG3蛋白表达敲低组中，与对照组相比，VEGFA、Ang2、THPO、PDGFB的mRNA有不同程度的表达上调；结合LRIG3蛋白过表达组中各因子mRNA表达的检测结果，仅有VEGFA mRNA的表达水平出现相应下调，而其他细胞因子的表达变化无显著统计学差异。Western Blot检测到各组胶质瘤细胞中VEGFA的蛋白表达变化和mRNA表达变化有相同的趋势，ELISA也证实各组的条件培养基中VEGFA的分泌水平有一致的变化。 　　结论：LRIG3蛋白通过抑制胶质瘤细胞VEGFA表达影响胶质瘤血管生成。 　　第五部分 LRIG3蛋白调节胶质瘤细胞VEGFA表达的分子机制 　　目的：既往研究表明胶质瘤中LRIG3蛋白表达水平和PI3K/AKT通路、ERK通路激活水平有相关性，而PI3K/AKT通路、ERK通路同时也是VEGFA表达调控的重要信号通路。在这部分研究中，我们拟探讨PI3K/AKT通路、ERK通路在LRIG3调节VEGFA表达中的作用，明确LRIG3蛋白影响胶质瘤细胞VEGFA表达的分子机制。 　　方法：在LRIG3蛋白表达敲低的U87、U251细胞系和相应对照组中，使用对应通路的特异性抑制剂（PI3K/AKT通路抑制剂LY292002、ERK通路抑制剂PD98059），并获取相应的条件培养基。Western Blot检测胶质瘤细胞中VEGFA蛋白水平的表达变化，ELISA检测VEGFA在条件培养基中的分泌水平，并检测各组条件培养基对脐静脉内皮细胞的迁移、增殖、微管结构形成能力的影响。在胶质瘤组织样本中，通过Western Blot和免疫组化，分析LRIG3表达水平和PI3K/AKT通路、ERK通路中AKT、ERK磷酸化水平、VEGFA表达水平的相关性。 　　结果：在U87、U251细胞系的LRIG3蛋白表达敲低组中，使用PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY292002后，与对照组相比，胶质瘤细胞表达VEGFA mRNA、蛋白的水平和分泌到条件培养基中的VEGFA蛋白水平均有显著下降，差异有统计学意义，p＜0.05。使用ERK通路特异性抑制剂PD98059后，对VEGFA的各项检测结果没有显著影响。血管内皮细胞功能实验结果证实，只有使用PI3K/AKT通路的特异性抑制剂LY292002，才能抑制LRIG3蛋白表达敲低的胶质瘤细胞对血管生成的促进作用。胶质瘤手术切除标本提取蛋白的Western Blot和组织免疫组化研究结果表明，LRIG3表达水平和AKT磷酸化水平、VEGFA表达水平负性相关。 　　结论：LRIG3蛋白通过抑制胶质瘤细胞中PI3K/AKT通路来抑制VEGFA表达。