摘要目的目前关于RSV(Respiratorysyncytialvirus,RSV)感染所致脑病的报道以临床特征和住院病例为主,对于其致病机理研究极少。本课题组之前的研究结果表明,TLR4(Toll-likereceptor4,TLR4)和核仁素(Nucleolin,NCL)可以协同介导RSV感染人中枢神经元细胞,但具体机制仍不十分清楚。因此,本课题的目的旨在为研究RSV感染神经元过程中,TLR4的TIR结构域与NCL的GAR结构域是否存在相互协同作用及其相关信号通路,为RSV与宿主相互作用机理研究和新的防治策略开发,提供新的思路。<br> 方法根据相应基因序列,由吉凯生物公司合成TIR(674-815aa)、TLR4(del674-815aa)、GAR(645-707aa)和NCL(del645-707aa)结构域慢病毒,同时按照相应实验分组,用构建好的慢病毒感染SY5Y细胞,经过药物筛选后构建稳定过表达细胞株。在体外培养的SY5Y细胞以及稳定过表达的SY5Y细胞株中,分别于4h、12h、24h和48h行RSV感染。运用激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀、蛋白免疫印迹、分子生物学、酶联免疫吸附法、流式细胞术等方法和技术,分别检测TIR/GAR结构域的共定位以及相互作用情况、p-NF-κB和LC3蛋白、TLR4/NCLmRNA、细胞因子和细胞凋亡的表达水平等,明确TLR4的TIR(674-815aa)结构域和NCL的GAR(645-707aa)结构域在神经元损伤中的协同作用,以阐明TIR(674-815aa)和GAR(645-707aa)在介导RSV感染所致神经神系统炎症的可能机制及相关信号通路。<br> 结果(1)激光共聚焦和免疫共沉淀结果显示:TIR(674-815aa)慢病毒和GAR(645-707aa)慢病毒共同感染SY5Y细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察到TIR(674-815aa)结构域和GAR(645-707aa)结构域存在共定位现象。RSV感染细胞后,裂解细胞用相应标签磁珠孵育处理后进行免疫共沉淀反应,结果显示:TIR(674-815aa)结构域和GAR(645-707aa)结构域存在相互作用。<br> (2)蛋白免疫印迹结果显示:p-NF-κB和LC3在未行RSV感染的细胞对照组(NC组)中表达水平低。NC组、TIR(674-815aa)结构域过表达组、GAR(645-707aa)结构域过表达组、TIR(674-815aa)结构域+GAR(645-707aa)结构域共同过表达组以及TLR4(del674-815aa)过表达组和NCL(del645-707aa)过表达组,在行RSV感染后,p-NF-κB表达量均有所增加,差异从4h开始具有显著统计学意义(###P<0.001)。其中TIR(674-815aa)+GAR(645-707aa)+RSV组的p-NF-κB和LC3表达水平升高最为明显,而TLR4(del674-815aa)+RSV组和NCL(del645-707aa)+RSV组p-NF-κB和LC3蛋白表达水平与NC+RSV组相持平,差异无统计学意义。<br> (3)实时荧光定量PCR结果显示:在未经过表达处理的SY5Y细胞(NC组)和过表达的各组SY5Y细胞中行RSV感染后,与NC组相比,RSV感染的各组细胞TLR4/NCLmRNA表达水平均升高,4h开始差异有统计学意义(###P<0.001)。与NC+RSV组相比,TIR(674-815aa)+RSV组、GAR(645-707aa)+RSV组,TIR(674-815aa)+GAR(645-707aa)+RSV组的TLR4/NCLmRNA表达水平均有一定程度的升高,升高从4h开始具有显著性差异(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);而TLR4(del674-815aa)+RSV组和NCL(del645-707aa)+RSV组的TLR4/NCLmRNA表达水平与NC+RSV组差异无统计学意义。<br> (4)酶联免疫吸附结果显示:未经过表达处理的SY5Y细胞对照组(NC组)中IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的浓度并不高,用RSV分别于4h、12h、24h和48h感染SY5Y细胞后,IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度逐渐升高,升高具有统计学差异(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001),IL-6和TNF-α从4h开始有统计学意义,IL-1β从12h开始有统计学意义。在过表达TIR(674-815aa)结构域过表达组、GAR(645-707aa)结构域过表达组,TIR(674-815aa)结构域和GAR(645-707aa)结构域共同过表达组中行RSV感染,与NC+RSV组相比,我们发现三组细胞分泌的IL-6、IL-1β和TNF-α均有一定程度的明显升高,差异具有显著性(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),其中TIR(674-815aa)+GAR(645-707aa)+RSV组分泌水平最高。然而,TLR4(del674-815aa)+RSV组和NCL(del645-707aa)+RSV组与NC+RSV组分泌水平相近,其并不能促进IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌,差异无统计学意义。<br> (5)流式细胞术结果显示:未经过表达处理的SY5Y细胞对照组(NC组)细胞凋亡较少;RSV作用48h后,细胞凋亡增加,凋亡增加有统计学差异(###P<0.001);TIR(674-815aa)结构域过表达组、GAR(645-707aa)结构域过表达组与TIR(674-815aa)和GAR(645-707aa)结构域共同过表达组在行RSV感染后,与NC+RSV组相比,细胞凋亡明显升高,凋亡升高有显著统计学差异(***P<0.001),且TIR(674-815aa)+GAR(645-707aa)+RSV组的细胞凋亡变化更为明显,而在TLR4(del674-815aa)+RSV组和NCL(del645-707aa)+RSV组中,细胞凋亡水平与NC+RSV组相当,差异无统计学意义。以上结果说明TLR4的TIR(674-815aa)结构域而非TLR4(del674-815aa)和NCL的GAR(645-707aa)结构域而非NCL(del645-707aa)可以协同作用于细胞凋亡的发生。<br> 结论在神经元SY5Y细胞中,TLR4的TIR(674-815aa)结构域而非TLR4(del674-815aa)区段,在RSV感染中起着重要作用;对于NCL而言,其GAR(645-707aa)结构域而非NCL(del645-707aa)同样可以介导RSV的感染。我们的结果表明,TIR结构域和GAR结构域的过表达可加剧细胞凋亡和自噬,TIR结构域和GAR结构域可以协同介导RSV感染,并激活NF-κB信号通路,调节下游炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的分泌,最终导致神经元损伤。
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