检索历史 清除

摘要目的目前关于RSV（Respiratorysyncytialvirus，RSV）感染所致脑病的报道以临床特征和住院病例为主，对于其致病机理研究极少。本课题组之前的研究结果表明，TLR4（Toll-likereceptor4，TLR4）和核仁素（Nucleolin，NCL）可以协同介导RSV感染人中枢神经元细胞，但具体机制仍不十分清楚。因此，本课题的目的旨在为研究RSV感染神经元过程中，TLR4的TIR结构域与NCL的GAR结构域是否存在相互协同作用及其相关信号通路，为RSV与宿主相互作用机理研究和新的防治策略开发，提供新的思路。<br>　　方法根据相应基因序列，由吉凯生物公司合成TIR（674-815aa）、TLR4（del674-815aa）、GAR（645-707aa）和NCL（del645-707aa）结构域慢病毒，同时按照相应实验分组，用构建好的慢病毒感染SY5Y细胞，经过药物筛选后构建稳定过表达细胞株。在体外培养的SY5Y细胞以及稳定过表达的SY5Y细胞株中，分别于4h、12h、24h和48h行RSV感染。运用激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀、蛋白免疫印迹、分子生物学、酶联免疫吸附法、流式细胞术等方法和技术，分别检测TIR/GAR结构域的共定位以及相互作用情况、p-NF-κB和LC3蛋白、TLR4/NCLmRNA、细胞因子和细胞凋亡的表达水平等，明确TLR4的TIR（674-815aa）结构域和NCL的GAR（645-707aa）结构域在神经元损伤中的协同作用，以阐明TIR（674-815aa）和GAR（645-707aa）在介导RSV感染所致神经神系统炎症的可能机制及相关信号通路。<br>　　结果（1）激光共聚焦和免疫共沉淀结果显示：TIR（674-815aa）慢病毒和GAR（645-707aa）慢病毒共同感染SY5Y细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察到TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域存在共定位现象。RSV感染细胞后，裂解细胞用相应标签磁珠孵育处理后进行免疫共沉淀反应，结果显示：TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域存在相互作用。<br>　　（2）蛋白免疫印迹结果显示：p-NF-κB和LC3在未行RSV感染的细胞对照组（NC组）中表达水平低。NC组、TIR（674-815aa）结构域过表达组、GAR（645-707aa）结构域过表达组、TIR（674-815aa）结构域+GAR（645-707aa）结构域共同过表达组以及TLR4（del674-815aa）过表达组和NCL（del645-707aa）过表达组，在行RSV感染后，p-NF-κB表达量均有所增加，差异从4h开始具有显著统计学意义（###P＜0.001）。其中TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组的p-NF-κB和LC3表达水平升高最为明显，而TLR4（del674-815aa）+RSV组和NCL（del645-707aa）+RSV组p-NF-κB和LC3蛋白表达水平与NC+RSV组相持平，差异无统计学意义。<br>　　（3）实时荧光定量PCR结果显示：在未经过表达处理的SY5Y细胞（NC组）和过表达的各组SY5Y细胞中行RSV感染后，与NC组相比，RSV感染的各组细胞TLR4/NCLmRNA表达水平均升高，4h开始差异有统计学意义（###P＜0.001）。与NC+RSV组相比，TIR（674-815aa）+RSV组、GAR（645-707aa）+RSV组，TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组的TLR4/NCLmRNA表达水平均有一定程度的升高，升高从4h开始具有显著性差异（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）；而TLR4（del674-815aa）+RSV组和NCL（del645-707aa）+RSV组的TLR4/NCLmRNA表达水平与NC+RSV组差异无统计学意义。<br>　　（4）酶联免疫吸附结果显示：未经过表达处理的SY5Y细胞对照组（NC组）中IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的浓度并不高，用RSV分别于4h、12h、24h和48h感染SY5Y细胞后，IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度逐渐升高，升高具有统计学差异（#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001），IL-6和TNF-α从4h开始有统计学意义，IL-1β从12h开始有统计学意义。在过表达TIR（674-815aa）结构域过表达组、GAR（645-707aa）结构域过表达组，TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域共同过表达组中行RSV感染，与NC+RSV组相比，我们发现三组细胞分泌的IL-6、IL-1β和TNF-α均有一定程度的明显升高，差异具有显著性（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），其中TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组分泌水平最高。然而，TLR4（del674-815aa）+RSV组和NCL（del645-707aa）+RSV组与NC+RSV组分泌水平相近，其并不能促进IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，差异无统计学意义。<br>　　（5）流式细胞术结果显示：未经过表达处理的SY5Y细胞对照组（NC组）细胞凋亡较少；RSV作用48h后，细胞凋亡增加，凋亡增加有统计学差异（###P＜0.001）；TIR（674-815aa）结构域过表达组、GAR（645-707aa）结构域过表达组与TIR（674-815aa）和GAR（645-707aa）结构域共同过表达组在行RSV感染后，与NC+RSV组相比，细胞凋亡明显升高，凋亡升高有显著统计学差异（***P＜0.001），且TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组的细胞凋亡变化更为明显，而在TLR4（del674-815aa）+RSV组和NCL（del645-707aa）+RSV组中，细胞凋亡水平与NC+RSV组相当，差异无统计学意义。以上结果说明TLR4的TIR（674-815aa）结构域而非TLR4（del674-815aa）和NCL的GAR（645-707aa）结构域而非NCL（del645-707aa）可以协同作用于细胞凋亡的发生。<br>　　结论在神经元SY5Y细胞中，TLR4的TIR（674-815aa）结构域而非TLR4（del674-815aa）区段，在RSV感染中起着重要作用；对于NCL而言，其GAR（645-707aa）结构域而非NCL（del645-707aa）同样可以介导RSV的感染。我们的结果表明，TIR结构域和GAR结构域的过表达可加剧细胞凋亡和自噬，TIR结构域和GAR结构域可以协同介导RSV感染，并激活NF-κB信号通路，调节下游炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的分泌，最终导致神经元损伤。