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摘要目的与背景<br>　　糖尿病肾病(DiabeticNephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症。DN是以血糖升高的血流动力学和代谢变化为经典的特征，但是巨噬细胞介导的慢性炎症在DN病理发展过程中被普遍认为是一个重要事件。因此任何抑制巨噬细胞免疫炎症的方式都将给DN的治疗带来希望，探究具体炎症作用靶点及筛选防治药物都具有重要的临床意义。<br>　　巨噬细胞具有表型可塑性强的特点，M1型巨噬细胞主要分泌细胞因子白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)等，促进炎症发生发展。一类长度大于200bp非编码转录本统称为长非编码RNA(LncRNA)，已被证明可以通过控制下游信号调节炎症因子及巨噬细胞表型，参与促炎、促纤维化，与糖尿病发病相关的慢性炎症有密切的关系。与此同时，发现持续的炎症损伤中，KLF4(Kruppel-likefactor4)同样参与相关调控，具体体现在抑制巨噬细胞功能转化，抑制炎症通路中核因子κb(Nuclearfactorκb,NFκB)的磷酸化，减少促炎因子释放。KLF4是一种进化保守并含有锌指结构的转录因子，同时也表现出抗炎抗纤维化作用，在糖尿病肾组织中KLF4表达明显较正常肾组织偏低。因此，探究可以改变巨噬细胞炎症方向的药物是缓解DN病情的迫切需要。汉黄芩苷(Wogonoside,WG)属于生物活性黄酮，是汉黄芩素的代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌的作用。目前关于DNM3OS与KLF4是否参与糖尿病肾脏炎症，WG是否具有抑制DN炎症进展及其机制尚未见报道。<br>　　本实验收集临床DN患者肾脏组织及血清标本，观察目的基因及炎症因子的表达情况；以巨噬细胞为研究对象，体外模拟糖尿病肾病内环境，并采用siRNA技术敲低DNM3OS基因，探究在高糖环境巨噬细胞激活中DNM3OS诱导相关信号通路的具体机制，并观察WG对巨噬细胞中相关信号通路蛋白及炎症因子的影响；以db/db鼠为体内研究对象，观测目的基因的表达及WG对DN肾脏炎症的影响。<br>　　方法<br>　　1.收集2019年6月到2020年6月安徽医科大学第一附属医院肾脏内科病理中心癌旁正常肾组织20例作为对照Normal组，DN患者肾组织35例作为DN组。将两组肾组织包埋、切片、染色，分别进行光镜分析及电镜观察，并统计两组病理损害的相关指标。统计各组研究对象糖化血红蛋白(Glycatedhemoglobin，HbA1C)、体重指数(BodyMassIndex,BMI)、血清肌酐(Serumcreatinine，Scr)、血压(Bloodpressure,BP)、尿素氮(Bloodureanitrogen，BUN)、尿酸(Uricacid，UA)、肾小球滤过率(Glomeruarfiltrationrate，GFR)和24小时尿白蛋白(Proteinuria)的一般指标。通过酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)可以检测出DN患者血清标本中白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)的含量，并将健康志愿者血清标本作为正常对照。荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)和RNA提取及定量逆转录聚合酶链反应(RNAisolationandquantitativereversetranscriptasePCR，RT-qPCR)检测两组肾组织的DNM3OS的表达情况。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肾组织CD68的和TNF-α的表达量。<br>　　2.选用小鼠RAW264.7巨噬细胞进行实验。首先通过CCK8筛选出WG的干预浓度范围，将实验分为：LG组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基)，D组(30mmol?L-1甘露醇培养基)，HG组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基)，LG+WG50组(5.5mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG)，HG+WG12.5组(30mmol?L-1葡萄糖+12.5μmol?L-1WG)，HG+WG25组(30mmol?L-1葡萄糖+25μmol?L-1WG)，HG+WG50组(30mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG)，通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测：LG组、LG+W50组、HG组和HG+WG50组细胞中诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的含量，Westernblot检测各组细胞NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的蛋白表达，RT-qPCR检测各组细胞KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达，ELISA检测各组细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量。RT-qPCR检测出各组细胞的DNM3OS的表达情况，再通过siRNA转染沉默DNM3OS基因，运用Westernblot筛选出最高转染效率试剂，将实验组分为：LG组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基)，LG+siRNA对照组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基+siRNA)，LG+WG50组(5.5mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG)，HG组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基)，HG+siDNM3OS组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基+siDNM3OS)，HG+WG50组(30mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG)，通过Westernblot检测各组细胞中NFκB-pp65、KLF4、TNF-α、IL-1β的蛋白表达，RT-qPCR检测KLF4、TNF-α、IL-1β的mRNA表达情况。<br>　　3.饲养若干雄性db/m、db/db鼠6周后分组：db/m组、db/m+WG50组、db/db组、db/db+WG12.5组、db/db+WG25组、db/db+WG50组，进行12周的药物干预。饲养结束后，放置代谢笼收集各组小鼠24h尿液，再去眼球取血清，取出肾组织称重，记录肾重/体重比。通过PAS染色光学显微镜观察肾脏组织病理损伤程度，并进行透射电镜的超微结构观察。IHC检测小鼠肾组织中炎症指标iNOS、TNF-α在db/m组、db/m+W50组、db/db组、db/db+WG50组中的表达情况。运用Westernblot检测各组小鼠肾组织NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的蛋白表达，RT-qPCR检测各组小鼠肾组织DNM3OS、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达，ELISA检测各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量。<br>　　结果<br>　　1.PAS染色结果显示DN组肾小球系膜扩张指数增大(p＜0.01)，肾小管间质损伤重(p＜0.01)，肾小球直径增大(p＜0.01)，电镜结果DN组显示基底膜厚度增加(p＜0.01)。ELISA结果显示DN组血清较Normal组IL-1β、TNF-α炎症因子增高(p＜0.01)。IHC结果显示DN组肾组织巨噬细胞标志物CD68和炎症因子TNF-α表达增加(p＜0.01)。FISH结果显示DNM3OS在DN组中表达增高(p＜0.01)。<br>　　2.CCK8显示在0-50μmol?L-1时WG对细胞活性没有影响。荧光显微镜显示较LG组，HG组iNOS表达增加(p＜0.01)；较HG组，WG组iNOS表达减少(p＜0.01)。Westernblot和RT-PCR结果显示较LG组，HG组DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β增高(p＜0.01)，KLF4降低(p＜0.01)；WG干预后较HG组DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β剂量依赖性降低(p＜0.01)，KLF4剂量依赖性增高(p＜0.01)；DNM3OS沉默后，较HG组HG+siDNM3OS组NFκB-pp65、TNF-α、IL-1β表达减少，KLF4表达增加(p＜0.01)，HG+WG50组NFκB-pp65、TNF-α、IL-1β表达减少，KLF4表达增加(p＜0.01)。ELISA结果显示HG组中TNF-α和IL-1β增加(p＜0.01)，药物干预后减少(p＜0.01)。<br>　　3.12周后与db/m组比较，db/db组血糖、24h尿蛋白代谢率、肾重/体重比较db/m组显著增加（p＜0.01），db/db加药组相关指标较db/db组下降（p＜0.01）。PAS染色结果显示db/db组肾小球系膜扩张指数增大(p＜0.01)，肾小管损伤程度重(p＜0.01)，肾小球直径增大(p＜0.01)，db/db加药组的病理损伤得到了明显改善(p＜0.01)。电镜结果db/db组显示基底膜厚度增加(p＜0.01)，db/db加药组得到了明显改善(p＜0.01)。ELISA结果显示db/db组血清较db/m组炎症因子TNF-α、IL-1β增高(p＜0.01)，db/db加药组较db/db组炎症因子减少(p＜0.01)。Westernblot和RT-qPCR结果显示db/db组肾组织DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β增高(p＜0.01)，KLF4降低(p＜0.01)；WG干预后DNM3OS、NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β剂量依赖性降低(p＜0.01)，KLF4剂量依赖性增高(p＜0.01)。<br>　　结论<br>　　1.糖尿病肾病患者肾脏中DNM3OS表达增高，肾组织系膜扩张指数增高，患者血清中TNF-α、IL-1β增高，发现DNM3OS与DN发展可能有密切关系。<br>　　2.高糖能够诱导RAW264.7细胞活化，促进DNM3OS表达的上调，细胞内炎症机制触发，炎症因子在细胞和细胞上清液中TNF-α、IL-1β的释放量均增加，NFκB磷酸化途径激活增加，转录因子KLF4的表达受到抑制；WG干预可抑制高糖诱导的巨噬细胞活化，抑制DNM3OS的表达和巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放，促进KLF4的表达。沉默DNM3OS基因可以抑制高糖诱导的巨噬细胞活化，NFκB磷酸化途径激活减弱，抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放，促进KLF4的表达。<br>　　3.db/db小鼠肾组织系膜扩张指数增高，DNM3OS表达的上调，肾组织中NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β表达增加，KLF4表达下降。WG干预可抑制db/db小鼠肾组织中DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β表达，KLF4表达增加。