摘要目的与背景<br> 糖尿病肾病(DiabeticNephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症。DN是以血糖升高的血流动力学和代谢变化为经典的特征,但是巨噬细胞介导的慢性炎症在DN病理发展过程中被普遍认为是一个重要事件。因此任何抑制巨噬细胞免疫炎症的方式都将给DN的治疗带来希望,探究具体炎症作用靶点及筛选防治药物都具有重要的临床意义。<br> 巨噬细胞具有表型可塑性强的特点,M1型巨噬细胞主要分泌细胞因子白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)等,促进炎症发生发展。一类长度大于200bp非编码转录本统称为长非编码RNA(LncRNA),已被证明可以通过控制下游信号调节炎症因子及巨噬细胞表型,参与促炎、促纤维化,与糖尿病发病相关的慢性炎症有密切的关系。与此同时,发现持续的炎症损伤中,KLF4(Kruppel-likefactor4)同样参与相关调控,具体体现在抑制巨噬细胞功能转化,抑制炎症通路中核因子κb(Nuclearfactorκb,NFκB)的磷酸化,减少促炎因子释放。KLF4是一种进化保守并含有锌指结构的转录因子,同时也表现出抗炎抗纤维化作用,在糖尿病肾组织中KLF4表达明显较正常肾组织偏低。因此,探究可以改变巨噬细胞炎症方向的药物是缓解DN病情的迫切需要。汉黄芩苷(Wogonoside,WG)属于生物活性黄酮,是汉黄芩素的代谢产物,具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌的作用。目前关于DNM3OS与KLF4是否参与糖尿病肾脏炎症,WG是否具有抑制DN炎症进展及其机制尚未见报道。<br> 本实验收集临床DN患者肾脏组织及血清标本,观察目的基因及炎症因子的表达情况;以巨噬细胞为研究对象,体外模拟糖尿病肾病内环境,并采用siRNA技术敲低DNM3OS基因,探究在高糖环境巨噬细胞激活中DNM3OS诱导相关信号通路的具体机制,并观察WG对巨噬细胞中相关信号通路蛋白及炎症因子的影响;以db/db鼠为体内研究对象,观测目的基因的表达及WG对DN肾脏炎症的影响。<br> 方法<br> 1.收集2019年6月到2020年6月安徽医科大学第一附属医院肾脏内科病理中心癌旁正常肾组织20例作为对照Normal组,DN患者肾组织35例作为DN组。将两组肾组织包埋、切片、染色,分别进行光镜分析及电镜观察,并统计两组病理损害的相关指标。统计各组研究对象糖化血红蛋白(Glycatedhemoglobin,HbA1C)、体重指数(BodyMassIndex,BMI)、血清肌酐(Serumcreatinine,Scr)、血压(Bloodpressure,BP)、尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)、尿酸(Uricacid,UA)、肾小球滤过率(Glomeruarfiltrationrate,GFR)和24小时尿白蛋白(Proteinuria)的一般指标。通过酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)可以检测出DN患者血清标本中白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的含量,并将健康志愿者血清标本作为正常对照。荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)和RNA提取及定量逆转录聚合酶链反应(RNAisolationandquantitativereversetranscriptasePCR,RT-qPCR)检测两组肾组织的DNM3OS的表达情况。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肾组织CD68的和TNF-α的表达量。<br> 2.选用小鼠RAW264.7巨噬细胞进行实验。首先通过CCK8筛选出WG的干预浓度范围,将实验分为:LG组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基),D组(30mmol?L-1甘露醇培养基),HG组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基),LG+WG50组(5.5mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG),HG+WG12.5组(30mmol?L-1葡萄糖+12.5μmol?L-1WG),HG+WG25组(30mmol?L-1葡萄糖+25μmol?L-1WG),HG+WG50组(30mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG),通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测:LG组、LG+W50组、HG组和HG+WG50组细胞中诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的含量,Westernblot检测各组细胞NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的蛋白表达,RT-qPCR检测各组细胞KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达,ELISA检测各组细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量。RT-qPCR检测出各组细胞的DNM3OS的表达情况,再通过siRNA转染沉默DNM3OS基因,运用Westernblot筛选出最高转染效率试剂,将实验组分为:LG组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基),LG+siRNA对照组(5.5mmol?L-1葡萄糖的培养基+siRNA),LG+WG50组(5.5mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG),HG组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基),HG+siDNM3OS组(30mmol?L-1葡萄糖的培养基+siDNM3OS),HG+WG50组(30mmol?L-1葡萄糖+50μmol?L-1WG),通过Westernblot检测各组细胞中NFκB-pp65、KLF4、TNF-α、IL-1β的蛋白表达,RT-qPCR检测KLF4、TNF-α、IL-1β的mRNA表达情况。<br> 3.饲养若干雄性db/m、db/db鼠6周后分组:db/m组、db/m+WG50组、db/db组、db/db+WG12.5组、db/db+WG25组、db/db+WG50组,进行12周的药物干预。饲养结束后,放置代谢笼收集各组小鼠24h尿液,再去眼球取血清,取出肾组织称重,记录肾重/体重比。通过PAS染色光学显微镜观察肾脏组织病理损伤程度,并进行透射电镜的超微结构观察。IHC检测小鼠肾组织中炎症指标iNOS、TNF-α在db/m组、db/m+W50组、db/db组、db/db+WG50组中的表达情况。运用Westernblot检测各组小鼠肾组织NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的蛋白表达,RT-qPCR检测各组小鼠肾组织DNM3OS、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达,ELISA检测各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量。<br> 结果<br> 1.PAS染色结果显示DN组肾小球系膜扩张指数增大(p<0.01),肾小管间质损伤重(p<0.01),肾小球直径增大(p<0.01),电镜结果DN组显示基底膜厚度增加(p<0.01)。ELISA结果显示DN组血清较Normal组IL-1β、TNF-α炎症因子增高(p<0.01)。IHC结果显示DN组肾组织巨噬细胞标志物CD68和炎症因子TNF-α表达增加(p<0.01)。FISH结果显示DNM3OS在DN组中表达增高(p<0.01)。<br> 2.CCK8显示在0-50μmol?L-1时WG对细胞活性没有影响。荧光显微镜显示较LG组,HG组iNOS表达增加(p<0.01);较HG组,WG组iNOS表达减少(p<0.01)。Westernblot和RT-PCR结果显示较LG组,HG组DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β增高(p<0.01),KLF4降低(p<0.01);WG干预后较HG组DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β剂量依赖性降低(p<0.01),KLF4剂量依赖性增高(p<0.01);DNM3OS沉默后,较HG组HG+siDNM3OS组NFκB-pp65、TNF-α、IL-1β表达减少,KLF4表达增加(p<0.01),HG+WG50组NFκB-pp65、TNF-α、IL-1β表达减少,KLF4表达增加(p<0.01)。ELISA结果显示HG组中TNF-α和IL-1β增加(p<0.01),药物干预后减少(p<0.01)。<br> 3.12周后与db/m组比较,db/db组血糖、24h尿蛋白代谢率、肾重/体重比较db/m组显著增加(p<0.01),db/db加药组相关指标较db/db组下降(p<0.01)。PAS染色结果显示db/db组肾小球系膜扩张指数增大(p<0.01),肾小管损伤程度重(p<0.01),肾小球直径增大(p<0.01),db/db加药组的病理损伤得到了明显改善(p<0.01)。电镜结果db/db组显示基底膜厚度增加(p<0.01),db/db加药组得到了明显改善(p<0.01)。ELISA结果显示db/db组血清较db/m组炎症因子TNF-α、IL-1β增高(p<0.01),db/db加药组较db/db组炎症因子减少(p<0.01)。Westernblot和RT-qPCR结果显示db/db组肾组织DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β增高(p<0.01),KLF4降低(p<0.01);WG干预后DNM3OS、NFκB-pp65、KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β剂量依赖性降低(p<0.01),KLF4剂量依赖性增高(p<0.01)。<br> 结论<br> 1.糖尿病肾病患者肾脏中DNM3OS表达增高,肾组织系膜扩张指数增高,患者血清中TNF-α、IL-1β增高,发现DNM3OS与DN发展可能有密切关系。<br> 2.高糖能够诱导RAW264.7细胞活化,促进DNM3OS表达的上调,细胞内炎症机制触发,炎症因子在细胞和细胞上清液中TNF-α、IL-1β的释放量均增加,NFκB磷酸化途径激活增加,转录因子KLF4的表达受到抑制;WG干预可抑制高糖诱导的巨噬细胞活化,抑制DNM3OS的表达和巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放,促进KLF4的表达。沉默DNM3OS基因可以抑制高糖诱导的巨噬细胞活化,NFκB磷酸化途径激活减弱,抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放,促进KLF4的表达。<br> 3.db/db小鼠肾组织系膜扩张指数增高,DNM3OS表达的上调,肾组织中NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β表达增加,KLF4表达下降。WG干预可抑制db/db小鼠肾组织中DNM3OS、NFκB-pp65、iNOS、TNF-α、IL-1β表达,KLF4表达增加。
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