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摘要背景<br>　　双酚类物质作为环氧树脂和聚碳酸酯塑料的主要生产原料被广泛生产和应用。双酚类物质的典型代表——双酚A（bisphenolA,BPA）普遍存在于多种环境介质和人体生物样本中。流行病学研究和动物实验均表明BPA存在多种毒性，因此，很多国家和地区都严格地限制BPA的使用。BPAF（bisphenolAF,BPAF）作为BPA的替代物被广泛应用于氟弹性体，食品包装材料和电子材料的生产与制造。与BPA类似，人类可通过多种途径暴露于BPAF，多种人体生物样本均可频繁的检出BPAF。由于BPAF是新兴的化学物，目前关于其神经毒性研究较少，既往有限的动物实验研究报道了孕期或围产期BPAF暴露可导致子代神经行为损伤，但尚无青春期BPAF暴露对神经行为影响及机制的研究。青春期是整个生命周期中至关重要的发育阶段，在此阶段神经系统对化学物暴露尤为敏感。根据WHO报道，在全球范围内10-19岁青春期人群中，有七分之一饱受精神障碍困扰。因此有必要探讨青春期BPAF暴露对神经行为的影响及其机制。本研究采用巢式病例对照研究设计，在人群层面探索BPAF暴露与神经行为损伤之间的关联；通过整体动物实验和体外细胞实验相结合进一步确证BPAF对神经行为的损伤并探索其相关机制。本研究将为BPAF的神经毒性提供流行病学证据，为进一步探索BPAF神经毒性的分子机制提供理论基础。<br>　　研究一青少年初中生血清BPAF暴露水平与抑郁症状发生风险的前瞻性巢式病例对照研究<br>　　目的<br>　　通过人群流行病学研究，评估青少年初中生血清BPAF的暴露水平；探讨血清BPAF水平与抑郁症状之间的关联；探讨血清BPAF水平与抑郁症状之间关联的性别差异及剂量-反应关系。<br>　　方法<br>　　本次前瞻性巢式病例对照研究基于一项正在进行的青少年初中生队列研究而设计，该队列于2019年进行基线调查和血清样本收集，于2020年进行第一次随访。第一次随访检出新发抑郁症状人数175例（病例组），根据性别和年龄（±1岁）进行1∶1匹配，在两次调查均无抑郁症状人群中选取175例作为对照组。采用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法（UltraPerformanceLiquidChromatography-tripleQuadrupoleMassSpectrometry,UPLC-MS/MS）检测基线血清BPAF水平并进行描述性分析，将血清BPAF原始浓度和经对数转换后的浓度纳入模型分析。采用条件logistic回归分析血清BPAF水平与抑郁症状发生风险之间的关联；按照性别分层，分析性别对血清BPAF水平与抑郁症状之间关联的修饰作用。采用限制性立方样条函数（restrictedcubicspline，RCS）探讨血清BPAF水平与抑郁症状发生风险之间的剂量-反应关系。<br>　　结果<br>　　本研究青少年初中生血清BPAF检出率为100%，病例组血清BPAF浓度中位数（四分位间距）为5.24（4.41-6.11）pg/mL，对照组血清BPAF浓度中位数（四分位间距）为4.86（4.02-5.77）pg/mL，病例组血清BPAF水平显著高于对照组（P=0.009）。将血清BPAF原始浓度纳入条件logistic回归模型并调整所有混杂因素后，结果显示，血清BPAF暴露是抑郁症状的危险因素（OR=1.132，95%CI：1.013-1.264）。将对数转换后的血清BPAF浓度根据对照组浓度三分位分组后纳入条件logistic回归模型并调整所有混杂因素后，结果显示，高暴露组抑郁症状发生风险是低暴露组的2.806倍（95%CI：1.188-6.626）。性别分层分析结果显示，男性高暴露组抑郁症状发生风险是低暴露组的3.858倍（95%CI：1.118-12.535），而女性BPAF暴露与抑郁症状发生风险无显著性关联。RCS分析结果显示，总人群和男性血清BPAF水平与抑郁症状之间均存在显著的线性剂量-反应关系。<br>　　结论<br>　　本次研究对象青少年初中生普遍暴露于较低水平的BPAF，血清BPAF水平与抑郁症状发生风险存在显著正向关联，性别对BPAF与抑郁症状之间关系存在修饰作用，男性更易受到BPAF暴露的影响。<br>　　研究二青春期BPAF暴露对小鼠神经行为及神经可塑性的影响<br>　　目的<br>　　通过动物实验进一步确证青春期BPAF暴露对神经行为（抑郁样行为和认知功能）的损伤作用，探讨BPAF的血脑屏障通透性并探讨BPAF暴露对小鼠海马和前额叶皮层结构及突触可塑性的影响。<br>　　方法<br>　　实验一：给予PND56雄性小鼠暴露0.34mg/kg的BPAF，分别于染毒后15min、30min、60min、120min和240min收集血液和脑组织，使用UPLC-MS/MS检测血浆和脑组织中BPAF水平的动态变化，计算BPAF脑血分配系数（Kp,brain）的变化情况。实验二：将青春期雄性小鼠分为4组，分别给予空白溶剂对照溶液（0mg/kg），低剂量（0.034mg/kg），中剂量（0.34mg/kg）和高剂量（3.4mg/kg）BPAF连续4周（PND28-PND56）灌胃染毒处理。染毒结束后进行糖水偏好实验，旷场实验和水迷宫实验。实验三：将青春期雄性小鼠分为4组，分别给予空白溶剂对照溶液（0mg/kg），低剂量（0.034mg/kg），中剂量（0.34mg/kg）和高剂量（3.4mg/kg）BPAF连续4周（PND28-PND56）的灌胃染毒处理。染毒结束后收集脑组织并计算脏器系数，通过HE染色，尼氏染色和高尔基染色检测脑组织（海马和前额叶皮层）形态学，树突复杂程度和突触可塑性变化；通过透射电镜检测突触超微结构；通过westernblotting检测突触可塑性相关分子指标。<br>　　结果<br>　　小鼠血浆和脑组织中游离型BPAF和总BPAF浓度均在染毒30min达到最高，游离型BPAF和总BPAF的Kp,brain均在60min时达到最高，对应的Kp,brain值分别为8.79和0.50，提示游离型BPAF具有较强的血脑屏障通透性并且更易在脑中聚集。在整个染毒期间，BPAF对小鼠体重，饮水和进食量均无显著影响。BPAF暴露对小鼠脑组织重量和海马重量及其系数均无显著影响。糖水偏好实验结果表明，所有BPAF暴露组的小鼠糖水偏好率均显著低于对照组；旷场实验结果显示，所有剂量的BPAF暴露均可降低小鼠的旷场移动总距离、中央区域移动距离、中央区域停留时间，进入中央区域次数和穿越格子数；水迷宫实验结果表明，所有浓度的BPAF暴露对小鼠的游泳速度均无显著影响，但所有计量BPAF暴露均可显著延长小鼠逃离潜伏期和游泳距离，并明显降低小鼠目标象限停留时间。HE染色和尼氏染色结果显示，BPAF暴露可改变小鼠海马和前额叶皮层神经元的形态，降低海马CA1区和前额叶皮层存活神经元个数。高尔基染色结果显示，所有剂量BPAF暴露均可降低小鼠海马CA1区和DG区神经元复杂程度，导致海马CA1区、DG区和前额叶皮层树突棘密度的降低。透射电镜结果显示，BPAF暴露可改变前额叶皮层和海马CA1区的突触超微结构。Westernblotting结果表明，所有剂量BPAF暴露均可显著下调海马和前额叶皮层PSD-95和Synapsin-1蛋白的表达；所有剂量BPAF暴露对小鼠海马ERα和ERβ的表达无显著影响，而中剂量和高剂量BPAF暴露可升高前额叶皮层ERβ表达。<br>　　结论<br>　　游离型BPAF更容易通过血脑屏障在脑组织中蓄积；青春期BPAF暴露可导致小鼠产生抑郁和焦虑样行为，并导致认知功能损伤。BPAF暴露可影响小鼠海马和前额叶皮层神经元复杂程度，降低树突棘密度和损害突触超微结构，并导致突触可塑性相关蛋白PSD-95和Synapsin-1蛋白表达下调。综上，BPAF可透过血脑屏障，损伤小鼠海马和前额叶皮层的神经元形态和神经可塑性，进而导致神经行为损伤。<br>　　研究三ROS介导的内质网PERK/ATF4信号激活在BPAF暴露导致神经行为损伤中的作用<br>　　目的<br>　　通过体内实验和体外实验相结合，探讨ROS介导的内质网PERK/ATF4信号激活在BPAF暴露导致神经行为损伤中的作用。<br>　　方法<br>　　动物实验：将青春期小鼠分为4组，分别给予空白溶剂对照溶液（0mg/kg），低剂量（0.034mg/kg），中剂量（0.34mg/kg）和高剂量（3.4mg/kg）BPAF连续4周（PND28-PND56）的灌胃染毒处理。染毒结束后收集脑组织，检测脑组织中氧化应激指标（MDA和SOD）；采用RT-qPCR检测海马和前额叶皮层Bdnf的mRNA水平；采用westernblotting检测海马和前额叶皮层p-CREB、CREB、BDNF、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、NOX4、HO-1和SOD2蛋白表达水平。<br>　　细胞实验：实验一：SH-SY5Y细胞暴露于BPAF（25μM）持续不同时间（0、6、12和24h）。染毒结束后收集细胞，采用RT-qPCR检测细胞的BDNFmRNA水平；采用westernblotting检测细胞的p-CREB、CREB、BDNF、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α和ATF4蛋白表达水平。实验二：采用25μM的BPAF处理SH-SY5Y细胞持续不同时间（0、2、6和12h）。染毒结束后,采用DCFH-DA染色检测细胞ROS水平；采用westernblotting检测NOX4、HO-1和SOD2蛋白的水平。实验三：采用PERK活化特异性抑制剂GSK2606414（GSK）共孵育，将SH-SY5Y分为对照组、GSK孵育组、BPAF暴露组、BPAF+GSK共孵育组，对应处理12h后收集细胞提取蛋白，采用RT-qPCR检测细胞的BDNFmRNA水平；采用westernblotting检测细胞p-CREB、CREB、BDNF、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α和ATF4蛋白表达水平。实验四：采用抗氧化剂NAC共孵育，将SH-SY5Y分为对照组、NAC孵育组、BPAF暴露组、BPAF+NAC共孵育组，对应处理12h后，采用DCFH-DA染色检测细胞ROS水平；采用RT-qPCR检测细胞的BDNFmRNA水平，采用westernblotting检测NOX4、HO-1、SOD2、p-CREB、CREB、BDNF、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α和ATF4蛋白表达水平。<br>　　结果<br>　　RT-qPCR结果显示，BPAF暴露可显著降低小鼠海马和前额叶皮层以及SH-SY5Y细胞的BDNFmRNA水平，westernblotting结果显示BPAF暴露可显著降低小鼠海马和前额叶皮层以及SH-SY5Y细胞的BDNF和p-CREB水平，上调PERK/ATF4信号的表达。PERK活性抑制剂GSK可有效抑制BPAF导致的SH-SY5Y细胞PERK/ATF4信号激活，上调p-CREB和BDNF水平。氧化应激相关指标检测发现，BPAF暴露可导致小鼠海马和前额叶皮层氧化-抗氧化系统失衡发生氧化损伤；BPAF可导致SH-SY5Y细胞ROS过度生成，扰乱氧化-抗氧化系统，导致氧化应激。抗氧化剂NAC可有效抑制BPAF导致的SH-SY5Y细胞ROS过度产生，抑制细胞PERK/ATF4信号的激活，进而上调p-CREB和BDNF水平。<br>　　结论<br>　　BPAF暴露通过ROS介导的内质网PERK/ATF4信号激活下调CREB/BDNF通路导致神经行为损伤。<br>　　总结<br>　　本文流行病学研究发现青春期BPAF暴露以性别依赖的方式增加男性初中生抑郁症状发生风险；动物实验发现青春期BPAF暴露可导致小鼠神经行为损伤；机制探讨发现BPAF暴露导致海马和前额叶皮层神经元氧化应激，激活神经元内质网PERK/ATF4信号，从而抑制CREB/BDNF通路，下调海马和前额叶皮层神经元BDNF的表达降低；BDNF水平的降低可进一步导致神经元复杂程度和突触可塑性损伤，最终导致抑郁样行为的产生。