检索历史 清除

摘要黄原胶是一种用途极为广泛的微生物多糖，广泛应用于食品、石油开采、医药等行业。研究表明黄原胶诸多优异性能与其结构的侧链修饰程度密切相关。关于黄原胶生物合成的相关基因已被大量研究，通过基因工程技术改变黄原胶侧链修饰结构成为研究热点，甚至可以根据需求定向生产黄原胶产品。本研究以黄原胶生产菌XanthomonascampestrisNRRLB-1459（XcB-1459）为出发菌株，构建黄原胶侧链修饰相关基因缺失的突变体菌株、对突变体的黄原胶产物进行结构分析与稳定性测试，在此基础上在还原剂Na2SO3保护下利用无丙酮酸黄原胶与乙二醛的交联反应，得到一种热稳定性提升的特殊黄原胶产品，使其能够用于高温油藏驱油剂。本研究中利用基因工程技术对黄原胶合成基因进行修饰，改变了黄原胶特定性能，扩大了黄原胶应用范围，也为其它微生物多糖的开发提供新思路。本研究开展的工作如下：<br>　　1.构建黄原胶侧链修饰相关基因缺失突变体菌株<br>　　确定XcB-1459菌株中两种侧链修饰基因（gumF与gumL）序列，设计敲除片段连接至自杀质粒pK18mobsacB获得侧链修饰基因敲除载体。敲除载体导入XcB-1459中，通过两次同源重组获得侧链修饰基因缺失突变体菌株，分别是丙酮酸转移酶缺失突变体Xc-?gumL、乙酰转移酶Ⅰ缺失突变体Xc-?gumF和丙酮酸转移酶与乙酰转移酶Ⅰ均缺失突变体Xc-?F?L。<br>　　2.侧链结构改变的黄原胶发酵对比验证及结构分析<br>　　分别利用野生型与突变体菌株发酵获得天然黄原胶（XG）与侧链结构改变的黄原胶（无丙酮酸黄原胶XG-L、无内侧乙酰基黄原胶XG-F与无丙酮酸和无内侧乙酰基黄原胶XG-FL）。对XG-L、XG-F和XG-FL侧链修饰基团含量及分子量进行测定，XG-L与XG-FL中丙酮酸含量为0，XG-F与XG-FL中乙酰基含量大幅减少，四种黄原胶分子量并无差异，分布于1.8?107~3.5?107Da之间，证明菌株构建有效。<br>　　3.侧链结构改变的黄原胶稳定性测试<br>　　侧链结构改变后黄原胶的性质发生明显变化：低浓度下（≤0.2%w/v）XG-F粘度最高，浓度≥0.4%时XG-L粘度最高；XG-L耐酸性能优异，XG-F与XG-FL耐碱性能优异；在黄原胶溶液中分别添加NaCl（0～20%）和CaCl2（0～20%），随着盐浓度的提高，XG-F与XG-FL粘度下降，XG-L与XG粘度维持稳定，但在CaCl2存在时XG-L粘度升高，XG-FL表现为粘度先增加后降低。<br>　　4.侧链结构改变的黄原胶热稳定性测试<br>　　以90℃下粘度的维持时间为评价指标，对四种黄原胶溶液（0.3%）的热稳定性进行测定。结果显示XG热稳定性最为优异（9d），XG-L次之（7d），XG-F与XG-FL表现最差（3d）；向黄原胶溶液中添加乙二醛（0.1%）与Na2SO3（0.3%）后再进行热稳定性测试，XG-L与XG-FL粘度维持时间最长为72d，XG为34d；单独在黄原胶溶液中加入乙二醛或Na2SO3进行热稳定性测试，加入乙二醛后所有样品粘度均只维持3d，而加入Na2SO3后XG-L维持64d，且其粘度明显低于同时添加乙二醛与Na2SO3的样品，通过此实验认为乙二醛与Na2SO3共同作用下，XG-L热稳定性提升最大。<br>　　5.乙二醛与Na2SO3提升无丙酮酸黄原胶热稳定性的机理解析<br>　　XG-L去除丙酮酸后阴离子基团减少，与乙二醛发生交联反应，使得其在添加乙二醛与Na2SO3后热稳定性提升。XG-L与乙二醛和Na2SO3混合后的样品（XG-LC）的红外光谱（FTIR）和扫描电镜（SEM）分析结果显示；XG-LC中的C-O和C-O-C拉伸振动（1050cm?1和1022cm?1）相较其他样品明显增强，SEM图像中XG-LC出现了致密的层状结构，证实XG-L与乙二醛分子发生交联反应。<br>　　6.XG-LC的流变性能<br>　　从流动曲线扫描及频率扫描两个方面对XG-LC的流变性能进行测试，流动曲线数据显示XG-LC具有较高的零剪切粘度和抗剪切能力，频率扫描结果显示XG-LC拥有最高的储能模量与损耗模量,且储能模量始终大于损耗模量，这些结果表明XG-LC内部结构得到增强，具有较高的粘弹性。