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摘要目的：探究CTGF联合人前交叉韧带成纤维细胞Transwell共培养体系对Scx-hAMSCs体外向韧带细胞分化的影响。<br>　　方法：1）通过酶消化法从胎盘羊膜上分离出hAMSCs并进行传代培养，取传至第3代的hAMSCs进行细胞表型鉴定，检测hAMSCs向骨、软骨及脂细胞定向分化的能力。运用酶消化法从人前交叉韧带残端分离出hACLFs，免疫荧光染色检测I型胶原、III型胶原表达情况；通过CCK-8法比较hAMSCs与hACLF的增殖能力。<br>　　2）将目标质粒和对照质粒共同转染到HEK293T细胞，包装慢病毒后进行浓缩，进行滴度测定后对第3代hAMSCs进行转染，qPCR及WestenBlot对转染后的细胞进行Scx过表达验证。<br>　　3）联合使用CTGF及Transwell共培养体系进行诱导分化，按不同培养方案分为6组：（A）hAMSCs经CTGF诱导组、（B）hAMSCs+hACLFsTranswell共培养组、（C）Scx-hAMSCs组、（D）Scx-hAMSCs经CTGF诱导组（E）Scx-hAMSCs+hACLFsTranswell共培养组（F）Scx-hAMSCs经CTGF诱导+hACLFsTranswell共培养组。共培养组中两组细胞密度比为1:1。CCK-8法测定各组细胞增殖能力，分别于7、10、14天时对各组细胞的韧带相关基因和蛋白表达进行检测。<br>　　结果：1）运用酶消化法得到的hAMSCs数目多,呈梭形贴壁生长，旋转排列；细胞表型符合间充质干细胞的细胞表型特点，经定向诱导后可成骨、软骨、脂细胞分化，具备三系分化能力，符合MSCs特点。酶消化法提取的原代hACLFs数目较少，经传代扩增后呈长梭型规则排列；免疫荧光染色结果提示有Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；CCK-8检测结果表明hAMSCs体外增殖能力明显强于hACLFs，差异具有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　2）将构建的质粒转化扩增后进行内毒素提取，各自与Lenti-Mix混合，制备Lenti-Mix-DNA转染系统，感染HEK293T细胞，包装成慢病毒。将慢病毒浓缩后感染hAMSCs,qPCR和WestenBlot结果均显示Scx过表达组细胞中SCX表达显著高于空载组（Plt;0.05）。<br>　　3）CCK-8结果表明使用CTGF诱导后的实验组细胞增殖水平显著高于其他组（Plt;0.05）。免疫荧光检测结果提示各组Ⅲ型胶原、纤粘蛋白表达水平与时间呈正相关，其中CTGF联合共培养组14d时Ⅲ型胶原、纤粘蛋白表达更高。qPCR结果显示在14d时，各组Ⅲ型胶原、纤粘蛋白的mRNA表达显著上调（Plt;0.05），CTGF组及共培养组mRNA表达高于Scx-hAMSCs组。Westernblot结果示同一时间点共培养组I型、III型胶原蛋白表达量高于hAMSCs经CTGF诱导组及Scx-hAMSCs组。苦味酸天狼猩红染色显示，14d时各组胶原沉积明显增多，Scx-hAMSCs经CTGF诱导共培养组内的胶原分泌量更多。<br>　　结论：1）hAMSCs具备MSCs的表型特点，具备三系分化能力，体外增殖能力较hACLFs强。<br>　　2）慢病毒载体可将Scx基因转染至hAMSCs，并在宿主细胞中过表达。<br>　　3）CTGF与Transwell共培养系统在促进hAMSCs向韧带细胞分化上具有协同作用，二者联合使用效果优异；其中CTGF在维持细胞活性、促进细胞增殖方面效果更好，Transwell共培养在诱导细胞分化上作用更强。