检索历史 清除

摘要艾纳香油（BBO）是从药用植物艾纳香（Blumea balsamifera(L.)DC.）中提取获得的挥发油，前期研究表明其具有良好的抗金黄色葡萄球菌（S.aureus）活性，能够破坏细胞壁结构，但其如何影响细胞壁、作用靶点和物质基础是什么仍未见报道。因此，本文探讨BBO对S.aureus细胞壁膜结构及生理的影响，寻找BBO影响细胞壁的作用靶点以及筛选BBO中的抗菌活性物质及其可能的作用机制。<br>　　本研究首先采用烃类化合物吸附法（BATH）检测S.aureus细胞表面疏水性（CSH），采用光度法检测培养液中碱性磷酸酶（AKP）、β-半乳糖苷酶、K+、Mg2+的含量，并提取检测细胞肽聚糖（PG）以及观察细胞聚集情况，评价BBO对细胞壁和细胞膜的影响。其次采用TMT定量蛋白质组学技术分析BBO对S.aureus蛋白质组的影响，通过GO富集分析、KEGG通路分析、蛋白互作网络分析，筛选表达水平显著差异以及功能上对细菌生长至关重要的蛋白质采用RT-qPCR进行验证。接下来选择与细胞壁合成相关且表达显著差异的磷酸N-乙酰胞壁酰基五肽转移酶（MraY）和甘氨酸-甘氨酸内肽酶（LytM）作为靶点，从PDB数据库获取LytM的3D结构，采用同源建模方法获取MraY的3D结构并利用拉氏图、PROSA和ERRAT对此结构的可靠性进行评估，然后利用分子对接技术将BBO中的化合物与MraY、LytM进行对接打分，根据打分结果选择打分较高的化合物。采用二倍稀释法检测打分较高的化合物对S.aureus最小抑菌浓度（MIC），采用气相色谱（GC）法检测活性物质在BBO中的含量，RT-qPCR检测活性物质对S.aureus的mraY和lytM mRNA表达的影响，研究活性物质对S.aureus生长曲线、细胞膜通透性的影响，利用扫描电镜观察活性物质对S.aureus细胞形态的影响。<br>　　结果表明BBO能够极显著增大S.aureus细胞壁CSH（Plt;0.01），且具有浓度依赖性；观察到BBO能引起液体培养基下的S.aureus发生聚集；能够显著降低S.aureus细胞PG含量（Plt;0.05）；能增加AKP的量，但差异不显著（P?0.05）；较高浓度BBO能在较短时间内破坏细胞膜通透性导致β-半乳糖苷酶大量泄漏，而较低浓度BBO破坏细胞膜通透性的作用时间较长，β-半乳糖苷酶的泄漏量随时间延长而增多；BBO能极显著增加培养液中K+，Mg2+浓度（Plt;0.01）。蛋白质组学结果表明，BBO作用S.aureus后有187个蛋白的表达量显著上调（Plt;0.05），214个蛋白的表达量显著下调（Plt;0.05），这些蛋白参与了细菌氨基酸代谢、物质转运、细胞壁、细胞膜、转录、翻译、毒力等多种生物学过程，其中与氨基酸代谢相关的有：鸟氨酸氨基甲酰基转移酶、精氨酸脱亚胺酶等；与核糖体相关的有：50S核糖体蛋白L5、L13、L33，30S核糖体蛋白S7、S16、S20等；与细胞壁相关的有：MraY、LytM、d-丙氨酸-d-丙氨酸连接酶、D-丙氨酰载体蛋白等。以LytM和MraY作为靶点利用分子对接筛选出化合物蓝桉醇和长叶烯，其MIC值分别为7.81μg/mL和78.12μg/mL，它们在BBO中的含量分别为0.15%和0.14%，它们能够显著降低mraY mRNA的表达，显著增加lytM mRNA的表达（Plt;0.05），显著促进细胞集聚（Plt;0.05），显著增强细胞膜通透性（Plt;0.05），破坏细胞形态使细胞发生破孔褶皱破碎，从而达到抑制细菌生长的作用。<br>　　结果提示，BBO通过增大细胞壁CSH，不利于微生物进行代谢，促进细胞聚集，导致细菌无法摄取生长所需的营养物质而不能繁殖，降低细胞PG含量，破坏细胞膜及细胞壁完整性，影响S.aureus氨基酸代谢、物质转运、细胞壁、细胞膜、转录、翻译、毒力等多种过程。蓝桉醇和长叶烯是BBO中抗S.aureus的活性成分，能够影响mraY和lytM的mRNA表达，靶向LytM，MraY影响细胞壁的合成，促进细胞集聚，增强细胞膜通透性，破坏细胞形态使细胞发生破孔褶皱破碎从而发挥抗菌作用。这些将为进一步研究艾纳香油BBO抗菌机制和抗菌活性物质奠定了基础，有利于艾纳香的开发利用。