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摘要硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）是一类高度硫酸化的糖胺聚糖，其通过与多种功能蛋白（如各种生长因子）特异性结合，参与胚胎发育、细胞增殖、病毒感染、炎症、肿瘤发生和发展等诸多生理和病理过程的调控。其中，成纤维细胞生长因子家族（Fibroblast growth factors，FGFs），特别是FGF2是与HS相互作用的代表性蛋白。细胞表面的HS可与FGF2结合，作为FGF2与其受体（FGF receptor，FGFR）相互结合的辅助受体，参与调控FGF2下游信号通路（如MAPK信号通路）的转导，参与细胞增殖、迁移以及肿瘤发生与发展等生理和病理过程调控。HS的功能与其糖链精细结构有关，HS糖链结构的变化导致其与各种功能蛋白的结合能力发生改变，继而影响HS介导的信号通路的转导。因此，研究HS糖链精细结构与功能关系一直是糖生物学领域的研究热点，靶向HS糖链与功能蛋白相互作用也成为药物研发的潜在策略之一。本研究以一种由→4)-α-D-GlcNAc(1→4)-α-L-IdoA2S(1→重复二糖单元构成的HS结构类似物WJSPS为研究对象，研究了WJSPS与FGF2的结合能力及其对FGF2介导的MAPK信号通路、肿瘤细胞的增殖和迁移能力的调控作用，为进一步阐明HS与FGF2结合的结构基础以及靶向内源性HS调控肿瘤细胞FGF2信号通路的药物研发提供了新思路。主要研究内容及结果如下：<br>　　（1）IPTG诱导已转化pET-28a(+)-hbFGF质粒的BL21(DE3)菌株异源表达FGF2重组蛋白，利用Ni NTA Beads6FF凝胶柱亲和层析纯化后，经SDS-PAGE电泳检测，获得高纯度FGF2重组蛋白。<br>　　（2）研究WJSPS与FGF2体外结合能力及结合关键氨基酸位点。以heparin和HS为对照，将heparin，HS和WJSPS分别与不同浓度的FGF2体外共同孵育后经TBE-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测WJSPS与FGF2结合能力，结果显示WJSPS可与FGF2结合；进一步通过表面等离子共振实验确认二者间的亲和力，结果显示WJSPS与FGF2间的平衡解离常数KD(FGF2-WJSPS)小于KD(FGF2-HS)，表明WJSPS与FGF2间存在着比HS更强的亲和力。此外，利用FGF2的HS结合位点突变蛋白以及不同结构修饰的K5多糖对HS与FGF2结合的结构基础进行探究发现，FGF2蛋白中的Gln135和Ala137氨基酸残基对FGF2与WJSPS的结合至关重要，而HS与FGF2相互作用的最简精细化修饰要求为：HS糖链中GlcA需异构化为IdoA，同时IdoA的2-O或GlcNAc的N位具有硫酸化修饰。这一研究结果进一步阐明了HS糖链与FGF2相互结合，调控FGF2信号通路的结构基础。<br>　　（3）利用FGF2或联合不同浓度的HS或WJSPS处理CHO-677细胞（内源性HS缺陷型细胞株）后通过蛋白免疫印迹法检测FGF2介导的下游信号通路中ERK蛋白的磷酸化水平发现，与FGF2单独处理相比，与HS和WJSPS共处理均可以上调ERK蛋白的磷酸化水平，促进FGF2介导信号通路的转导。但WJSPS对胞内FGF2介导的MAPK信号通路的促进作用显著弱于HS。<br>　　（4）鉴于WJSPS具有FGF2高亲和力，但对FGF2信号通路活化作用较弱这一特性，利用癌细胞A549研究发现，与FGF2单独处理相比，WJSPS加入后ERK磷酸化蛋白水平显著下降，提示WJSPS可与内源性HS竞争FGF2，从而抑制FGF2诱导的MAPK信号通路转导。进一步研究发现，WJSPS可抑制FGF2介导的A549细胞的增殖和迁移。本研究结果将为靶向内源性HS调控肿瘤细胞FGF2信号通路的药物研发提供了新思路。