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摘要目的：<br>　　伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi）是肠杆菌科中人类特异性的肠道致病菌。磷酸转移酶系统（phosphotransferase system,PTS）不仅是重要的糖转运系统，还影响细菌的毒力调节。AI-2（Autoinducer-2）是细菌种间交流的通用信号分子，参与调节细菌的多种生物学行为。有研究称，PTS有助于AI-2的早期内化。本课题经S.Typhi两种菌株的转录组分析发现，luxS缺失能引起PTS中糖转运相关基因的mRNA水平变化，其中果糖转运蛋白的编码基因fruA在S.Typhi中尚未有过研究。本论文以PTS中的fruA为研究对象，探索该基因在S.Typhi信号分子AI-2内化过程中发挥的作用，以及fruA对S.Typhi毒力和生物膜形成的影响及相关的分子调控机制。<br>　　方法：<br>　　1.转录组测序分析：基于S.Typhi的野生株（WT）和luxS缺陷株（ΔluxS）对肠上皮细胞侵袭力的表型差异，分别提取这两种菌株对数早期的RNA做转录组测序分析。<br>　　2.qRT-PCR验证转录组测序结果：分别提取生长至对数早期的WT和ΔluxS的RNA，用qRT-PCR的方法验证转录组结果中与细菌侵袭及PTS中糖转运相关基因的mRNA表达水平。<br>　　3.构建相关菌株的缺失变异株：应用自杀质粒介导的同源臂重组法构建S.Typhi及大肠埃希菌相关的缺失变异株，S.Typhi的fruA缺陷株（ΔfruA）、luxS和fruA的双缺陷株（ΔluxSΔfruA）、luxS和lsrB的双缺陷株（ΔluxSΔlsrB）以及大肠埃希菌BL21的luxS缺陷株（BL21ΔluxS）。<br>　　4.AI-2的内化实验：利用哈氏弧菌BB170的化学发光实验检测不同时间点胞外AI-2信号分子的含量，从动力学水平上观测fruA对AI-2内化的影响；通过qRT-PCR检测fruA对已知AI-2内化相关操纵子lsr的调控作用；通过体外表达纯化获得的FruA蛋白与AI-2的结合和释放试验，从蛋白水平上检测fruA对AI-2内化的方式。<br>　　5.fruA高表达株的制备：设计fruA全长的特异性引物，利用质粒pBAD33构建高表达载体pBAD33-fruA，并将阳性重组载体及pBAD33空载体电转入WT中，amp;nbsp;制备fruA高表达菌株WT-pfruA及其空载体对照株WT-pBAD33。<br>　　6.生长曲线的测定：将过夜培养的细菌转接至新的培养液中，从0h开始监测，每隔1h测量一次吸光度A600的值，连续12h，用所得数据绘制生长曲线图，观察fruA对S.Typhi生长活性的影响。<br>　　7.泳动实验：将培养至对数早期的WT-pfruA和WT-pBAD33接种在0.3%的半固体培养基上，正置37℃孵箱中培养约10h后取出，测量细菌在平板上的动力圈直径，分析fruA对S.Typhi泳动能力的影响。<br>　　8.肠上皮细胞T84的侵袭实验：将WT-pfruA和WT-pBAD33培养至A600约为0.4时，以MOI=20:1的比例加入细菌到T84细胞中与之共培养90min，PBS冲洗2次。换新的含有100μg/mL庆大霉素的培养液继续孵育90min，弃培养液用PBS冲洗干净，加入0.5%Triton X-100裂解细胞后涂于含氯霉素的LB固体平板上过夜培养，次日进行菌落计数，比较两个菌株对T84细胞侵袭力的差异。<br>　　9.生物膜的形成实验：当WT-pfruA和WT-pBAD33在TSB培养基中生长至A600=0.4左右时，将菌液转接至96孔U型培养板中。4天后用结晶紫染色并检测细菌在595nm波长处的吸光度值A595，分析生物膜的形成量。<br>　　10.qRT-PCR检测动力、侵袭力及生物膜形成相关基因的转录水平：将WT-pfruA和WT-pBAD33培养至对数早期，通过Trizol法提取细菌RNA。用qRT-PCR分析fruA对S.Typhi动力、侵袭力及生物膜形成相关基因转录水平的影响。<br>　　结果：<br>　　1.转录组测序结果显示，与WT相比，ΔluxS中共有差异表达基因383个，其中270个上调基因，113个下调基因。<br>　　2.转录组测序结果验证，挑取与细菌侵袭prgK、orgA、invH、pagN、sipA、hilD及糖转运相关基因manY、manZ、fruA、treB进行qRT-PCR的分析验证，该结果中的mRNA表达水平与转录组测序结果趋势大体一致。<br>　　3.成功构建S.Typhi的相关缺陷株ΔfruA、ΔluxSΔfruA、ΔluxSΔlsrB以及大肠埃希菌BL21的缺陷株BL21ΔluxS。<br>　　4.AI-2内化实验显示，从动力学水平观察，fruA在前2h对AI-2的内化起促进作用，该表型与qRT-PCR结果中fruA对AI-2内化相关操纵子lsr起正调控作用的趋势一致；从FruA蛋白与AI-2在体外的结合和释放实验结果观察，fruA对AI-2的内化形式不是直接作为AI-2的受体与之结合。<br>　　5.成功构建高表达菌株WT-pfruA及其空载体对照株WT-pBAD33。<br>　　6.生长曲线结果表明，WT-pfruA与WT-pBAD33在LB液体培养基中的生长无明显差异。<br>　　7.泳动实验结果显示，与WT-pBAD33相比，WT-pfruA的动力圈直径明显增加。8.T84细胞侵袭实验结果显示，相比于WT-pBAD33，WT-pfruA对人结肠腺癌上皮细胞T84的侵袭能力有所增加。<br>　　9.生物膜形成实验结果表明，WT-pfruA的生物膜形成能力较WT-pBAD33显著增加。<br>　　10.qRT-PCR结果提示，与WT-pBAD33相比，WT-pfruA中动力flhD、fliA、fljB，侵袭力iagA、invF、invH及生物膜形成csgA、csgD、iagA相关基因的mRNA表达水平均有不同程度的上调。<br>　　结论：<br>　　本研究首次发现，S.Typhi中编码果糖特异性转运蛋白亚基EⅡBC的基因fruA，在群体感应信号分子AI-2的早期内化中起促进作用，但发挥该作用的具体方式有待进一步验证。此外，fruA基因还可促进S.Typhi的运动能力、侵袭能力以及生物膜的形成能力，并对其表型相关基因的转录起正调控作用。