检索历史 清除

摘要目的：<br>　　胃癌（gastric cancer，GC）在中国男性和女性恶性肿瘤中分别排在第二位和第五位，是癌症患者主要死因之一。早期胃癌患者的5年生存率明显高于转移癌患者，晚期患者存活期不超过1年。早期胃癌缺乏特定症状，中国80％以上的患者被诊断为晚期。近年来的研究发现lncRNA是功能强大的非编码RNA，可以调控包括胃癌在内的多种肿瘤。新发现的NPSR1-AS1定位7号染色体p14.3，首先报道在肝癌中高表达并与其预后相关，而NPSR1-AS1在胃癌中的表达情况、作用及机制犹未可知。本实验研究NPSR1-AS1在胃癌组织、血浆及细胞中的表达，结合临床资料分析其临床意义。进而通过后续实验进一步阐明NPSR1-AS1在胃癌中作用的具体机制，以期为胃癌的后续研究及临床诊疗提供帮助。<br>　　方法：<br>　　1、查找文献和生物信息学分析，筛选出lncRNA NPSR1-AS1；通过预实验RT-qPCR检测NPSR1-AS1在胃癌组织及细胞中的表达。<br>　　2、RT-qPCR检测NPSR1-AS1在胃癌组织及血浆的表达，并结合临床病理数据分析其与NPSR1-AS1表达量相关性；绘制生存曲线分析生存时间与NPSR1-AS1表达的相关性；绘制ROC曲线评估NPSR1-AS1在胃癌中的诊断水平。<br>　　3、通过siRNA干扰实验研究NPSR1-AS1对胃癌细胞生物学行为的影响。<br>　　4、通过RT-qPCR、数据库及文献查找NPSR1-AS1下游靶基因，通过Western blot、核质分离实验、RIP、ChIP探讨NPSR1-AS1在胃癌中作用的分子机制。<br>　　5、体外细胞功能学实验验证NPSR1-AS1调控GSK-3β通路对胃癌细胞生物学行为的作用。<br>　　结果：<br>　　1、NPSR1-AS1在胃癌中异常高表达；RT-qPCR结果显示NPSR1-AS1在胃癌细胞、血浆和组织系中的表达水平均升高；并且NPSR1-AS1表达量与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤血管或神经侵袭呈明显正相关；生存曲线结果显示，NPSR1-AS1高表达的患者较低水平患者总体生存率更低；NPSR1-AS1的血浆表达水平ROC曲线下面积为0.710，表明其在诊断胃癌方面有意义。<br>　　2、体外细胞功能实验结果表明，NPSR1-AS1敲减后能抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭，并诱导其凋亡。<br>　　3、RT-qPCR结果表明NPSR1-AS1敲减后可调控EMT相关基因，可上调GSK-3β来调节β-catenin水平，进而使E-cadherin表达水平升高，而使Snail及N-cadherin表达水平下降。Western blot实验也验证NPSR1-AS1可在蛋白水平影响GSK-3β、E-cadherin、β-catenin、Snail及N-cadherin的表达。Western blot实验结果与之一致。<br>　　4、核质分离实验发现NPSR1-AS1主要分布在细胞核中，表明NPSR1-AS1可能在转录水平发挥作用；RIP实验结果表明NPSR1-AS1主要与EZH2相结合；ChIP实验结果显示EZH2可与GSK-3β启动子区域结合。Western blot表明：NPSR1-AS1敲减后，E-cadherin及GSK-3β蛋白水平上调，β-catenin、N-cadherin及Snail蛋白水平下调；而EZH2敲减后与NPSR1-AS1敲减对基因的调控方向一致，表明两者或可在同一通路中发挥作用。此外，通过si-NPSR1-AS1与si-GSK-3β共转染后，结果显示si-GSK-3β完全逆转了si-NPSR1-AS1介导的靶基因调控作用。<br>　　5、体外细胞功能实验显示，EZH2敲减后与NPSR1-AS1敲减对细胞生物学表型影响的方向一致，包括细胞增殖、侵袭和迁移。此外，si-NPSR1-AS1与si-GSK-3β共转染后，结果显示si-GSK-3β完全逆转了si-NPSR1-AS1介导的细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用。<br>　　结论：<br>　　NPSR1-AS1在胃癌细胞、血浆和组织中显著高表达，表达量与淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤血管或神经侵袭呈明显正相关；NPSR1-AS1表达高的胃癌患者较表达低者预后更差，NPSR1-AS1血浆表达水平对诊断胃癌有价值；NPSR1-AS1与EZH2相互作用下调GSK-3β的表达来调控EMT基因促进EMT过程，进而促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，最终导致胃癌进展。总之，NPSR1-AS1与胃癌的发生发展和预后密切相关，有望成为胃癌的潜在诊断标志物及治疗靶标。